飼料用脂肪酶產(chǎn)生菌——黑曲霉G55高產(chǎn)菌株的選育

張 謙， 賈 佳， 林 智， 郭宏濤， 王劍英

（1.深圳技師學(xué)院科研辦，廣東深圳 518045；2.深圳市綠微康生物工程有限公司，廣東深圳 518055）

脂肪酶是脂肪代謝的關(guān)鍵酶，它可將脂肪水解為游離脂肪酸、甘油和甘油單酯供動物吸收利用（劉德海等，2012）。研究表明，單胃動物自身能夠分泌內(nèi)源性脂肪酶，但幼齡動物和特殊時期的動物，因為消化機(jī)能不健全或內(nèi)源性脂肪酶分泌不足，造成脂肪消化吸收率低，需要適當(dāng)添加外源性脂肪酶等以補(bǔ)充其內(nèi)源酶的不足，而提高動物存活率和生產(chǎn)性能（趙必和李學(xué)海，2014；翁曉輝等，2013）。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種重要的微生物，廣泛應(yīng)用于生物酶制造。工業(yè)育種技術(shù)的運用是提高菌種產(chǎn)量，降低發(fā)酵成本的重要手段之一。賀勝英等（2011）和朱琪等（2013）通過工業(yè)育種技術(shù)，對產(chǎn)脂肪酶黑曲霉實施誘變和選育獲得優(yōu)良菌株，提高菌株的產(chǎn)酶能力。本研究以脂肪酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger G55為出發(fā)菌株，分別采用紫外線（UV）和亞硝基胍（NTG）單因子誘變和復(fù)合誘變的方法處理菌株，使影響產(chǎn)量的基因發(fā)生突變，提高菌株的產(chǎn)酶能力，通過自然分離使正向突變株得到顯現(xiàn)，結(jié)合篩選最終獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)脂肪酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 黑曲霉為深圳綠微康生物工程有限公司提供，該菌株現(xiàn)保藏于公司酶制劑研究中心，保藏號：Aspergillus niger G55。

1.1.2 試劑和儀器 主要試劑：豆粕粉、蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、瓊脂等培養(yǎng)基所用試劑均為國產(chǎn)化學(xué)級試劑。亞硝基胍（NTG）購自sigma公司。

儀器：凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；檢測用臺式紫外燈（燈管為JLCT50330-10，深圳喬麟光電有限公司）；PHS-25型pH計（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）；Avanti J-30I高效離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂 15 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：NaNO33 g， 葡萄糖30 g，NaH2PO40.5 g，K2SO40.1 g，蒸餾水定容至 1000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕粉 40 g，NaNO310 g，葡萄糖 20 g， 玉米淀粉 10 g，NaH2PO42 g，K2SO40.2 g，CaCO35 g，蒸餾水定容至 1000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 斜面種子培養(yǎng)條件：將-80℃保藏的菌株或經(jīng)分離的單菌落，用接種針取1環(huán)均勻涂布于斜面培養(yǎng)基表面，于30℃恒溫靜置培養(yǎng)3 d，制備成斜面種子，于3～5℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

搖瓶種子培養(yǎng)條件：將斜面種子用接種針取1環(huán)接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，于30℃ 恒溫220 r/min振蕩培養(yǎng)20～32 h，見培養(yǎng)液渾濁，OD600值在0.24～0.5，得到搖瓶種子備用。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照1%接種量裝于有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，于30℃恒溫220 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h，發(fā)酵液在 10000 r/min，4℃離心 10 min，取上清液檢測脂肪酶活性。

1.2.2 誘變因子和誘變方法 自然分離方法：取斜面種子試管，加入5 mL無菌蒸餾水用接種針刮下表面孢子，轉(zhuǎn)移到盛有玻璃珠瓶中振蕩2 min形成單孢子懸液，孢子量約107個/mL，將該單孢子液稀釋，加入到20 mL斜面培養(yǎng)基的平皿中，控制菌落數(shù)為20～50個/皿，30℃靜置培養(yǎng)3 d，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定每一個菌落產(chǎn)脂肪酶活性。

UV誘變方法：取斜面種子制備成單孢子懸液，孢子量約107個/mL，取2 mL單孢子懸液于平皿中，在波長254 nm，功率10 W紫外燈下，照射距離20 cm，照射時間0～25 s，照射時將平皿往復(fù)振蕩，照射后的平皿用黑布包裹并在暗環(huán)境下稀釋分離，涂布平皿培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同自然分離方法。

NTG誘變方法：取斜面種子以pH 6.0磷酸緩沖液制備單孢子懸液，孢子量約107個/mL，取1 mL單孢子懸液于20 mL試管，加入3 mL的NTG溶液（最終濃度為1×10-6mmol/mL）充分混合，于30℃恒溫水浴振蕩處理0～60 min，將誘變后的菌懸液在10000 r/min，4℃離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌終止反應(yīng)，并進(jìn)行稀釋分離，涂布平皿培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同自然分離方法。

UV+NTG誘變方法：取斜面種子制備成單孢子懸液，孢子量約107個/mL，取2 mL單孢子懸液于平皿中，在紫外燈下照射15 s，取1 mL孢子液于20 mL試管中，加入3 mL的NTG溶液（最終濃度為1×10-6mmol/mL），充分混合，于30℃恒溫水浴振蕩處理0～60 min，誘變后的菌懸液處理方法同NTG誘變方法，培養(yǎng)方法同自然分離方法。

1.2.3 篩選方法 菌株經(jīng)過自然分離和不同誘變處理后分離得到的正常菌落直徑為1.5～2 mm，呈白色，邊緣整齊。觀察菌落形態(tài)，根據(jù)異常菌落和正常菌落的比值計算菌落變異率；用消毒牙簽取少許菌體接種于鑒別培養(yǎng)基平皿，根據(jù)菌落所形成的熒光圈大小，判斷該菌落產(chǎn)脂肪酶活性，實施菌落的初篩。對于初篩得到的高產(chǎn)菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)并進(jìn)行3批復(fù)篩，每一批復(fù)篩做3瓶平行，測定菌株的產(chǎn)脂肪酶活性。

1.2.4 斜面?zhèn)鞔囼?將經(jīng)過篩選得到的高產(chǎn)脂肪酶菌株的斜面種子連續(xù)傳接5代，實施搖瓶發(fā)酵，測定菌株經(jīng)過傳代后的產(chǎn)脂肪酶活力，考察菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 脂肪酶活性測定 初篩檢測方法：在斜面培養(yǎng)基中添加1.2 g/L三丁酸甘油脂和顯色劑羅丹明B（Rhodamine B,Sigma）構(gòu)成固體鑒別培養(yǎng)基，產(chǎn)脂肪酶的菌落在該培養(yǎng)基上可以形成淺黃色熒光圈，并判斷菌落的產(chǎn)脂肪酶活性（Kouker等1987）。

復(fù)篩檢測方法：以堿滴定法測定發(fā)酵液中脂肪酶活性。脂肪酶活性單位定義為：在一定溫度和pH條件下，每分鐘釋放出1μmol脂肪酸的酶量，定義為1 個酶活性單位，以 U/g（U/mL）表示（Tian 等 2013）。

2 結(jié)果及分析

2.1 誘變及篩選效果評價

2.1.1 UV誘變及篩選 當(dāng)UV照射微生物細(xì)胞時DNA大量吸收260nm光譜而引起突變或殺傷作用 （施巧琴和武松剛，2003）。以脂肪酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger G55為出發(fā)菌株，用UV照射0～25 s，稀釋分離，在平皿中培養(yǎng)得到單菌落。以未經(jīng)UV照射的G55菌株為對照，計算每個UV照射時間點的死亡率和菌落變異率，結(jié)果見圖1。從經(jīng)過UV照射的菌株中挑選出931株單菌落進(jìn)行初篩，確定了產(chǎn)酶活性高出對照菌株5%以上的菌落共92株，接種斜面實施復(fù)篩，經(jīng)過3批復(fù)篩，得到5個產(chǎn)脂肪酶活性穩(wěn)定高于G55菌株的菌株，結(jié)果見表1和表2。

圖1 UV對于G55菌株的誘變效果

表1 G55經(jīng)UV誘變的初篩結(jié)果

表2 G55與復(fù)篩菌株產(chǎn)脂肪酶活性比較

由圖1可見，G55菌株不實施UV照射的對照組，菌落自然變異率為2.1%。照射10～15 s時為亞致死量的照射時間，菌株死亡率為69.5%～74.7%，變異率為5.6%～7.8%。當(dāng)照射時間為20～25 s時，菌株死亡率96.6%～99.8%，變異率顯著提高。

由表1可見，經(jīng)過初篩進(jìn)入復(fù)篩的菌落大多集中在UV照射10、15、20 s的3個組中，出現(xiàn)正變菌株較多，復(fù)篩過程絕大多數(shù)菌株沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的高產(chǎn)特性，產(chǎn)脂肪酶活性退化。由表2可見，通過復(fù)篩的5個菌株以uv41最佳，UV照射時間為5 s，產(chǎn)脂肪酶活性為1948 U/mL，高于G55菌株6.7%。對此菌株進(jìn)行了2次分離純化得到uv41（s）。

2.1.2 NTG誘變及篩選 NTG是一種烷化劑，可以誘發(fā)并取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個或者多個堿基起烷基化作用，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引發(fā)突變 （施巧琴等，2003）。以Aspergillus niger uv41（s）為新的出發(fā)菌株，用 NTG誘變處理（最終濃度為1×10-6mmol/mL），經(jīng)過稀釋分離，在平皿中培養(yǎng)得到單菌落，誘變效果見圖2。從NTG誘變菌株中，挑選出1085個單菌落實施初篩，從中挑選112株接種斜面實施復(fù)篩，經(jīng)過3批復(fù)篩，得到8個產(chǎn)脂肪酶活性穩(wěn)定高于uv41（s）菌株的菌株，結(jié)果見表3和表4。

圖2 NTG對于uv41（s）菌株的誘變效果

表3 uv41（s）經(jīng)NTG誘變的初篩結(jié)果

表4 uv41（s）與復(fù)篩菌株產(chǎn)脂肪酶活性比較

由圖2可見，uv41（s）菌株不實施誘變的對照組，菌落自然變異率為2.7%。NTG誘變10～40 min時為亞致死誘變時間，死亡率為20.1%～45.4%；誘變50 min時，死亡率顯著提高，變異率僅為13.3%；當(dāng)誘變60 min以上時，菌株死亡率為82.2%，變異率接近24.7%。

由表3可見，經(jīng)過初篩進(jìn)入復(fù)篩的菌落大多集中在NTG誘變20、30、50 min 3個組中，出現(xiàn)正變菌株的幾率比較高，進(jìn)行復(fù)篩的110株，絕大多數(shù)菌株出現(xiàn)產(chǎn)脂肪酶活性退化。由表4可見，通過復(fù)篩的8株菌中以ntg349最佳，NTG誘變時間為30 min時，產(chǎn)脂肪酶活性為2323 U/mL，高于uv41（s）菌株15.7%。對此菌株進(jìn)行了2次分離純化得到 ntg349（s）。

2.1.3 UV+NTG復(fù)合誘變及篩選 不同誘變劑可以誘發(fā)菌株DNA發(fā)生不同形式的改變和變異，在微生物育種過程中通過有目的的選擇兩種或者兩種以上的誘變劑，實施復(fù)合誘變，可以實現(xiàn)DNA分子的多重變異和疊加效用，提高菌株對誘變劑的敏感性，獲得更好的育種效果 （施巧琴和武松剛，2003）。 以 Aspergillus niger ntg349（s）為出發(fā)菌株，采用UV+NTG復(fù)合誘變，首先用UV誘變，照射時間為15 s，然后，將孢子液加入到NTG溶液（最終濃度為1×10-6mmol/mL）中，誘變時間0～60 min，經(jīng)過稀釋分離，在平皿中培養(yǎng)得到單菌落，UV+NTG復(fù)合誘變效果評價見表5。挑選出1152株單菌落實施初篩，從中挑選118株接種斜面進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)過3批復(fù)篩，有11個菌株的產(chǎn)酶活性穩(wěn)定高于ntg349（s）菌株，結(jié)果見表6和表 7。

表5 UV+NTG對于ntg349（s）菌株的誘變效果

表6 ntg349（s）經(jīng)UV+NTG誘變的初篩結(jié)果

由表5可見，單獨使用UV照射ntg349（s）15 min時，菌株死亡率為67.2%，變異率為9.4%，與G55對UV的耐受程度相近。采用UV復(fù)合NTG誘變時，表現(xiàn)出較高的死亡率和變異率，隨著復(fù)合誘變劑量加大，菌株死亡率在90%以上，變異率在30%以上。

表 7 ntg349（s）與復(fù)篩菌株產(chǎn)脂肪酶活性比較

由表6可見，經(jīng)過初篩進(jìn)入復(fù)篩的菌落在UV+NTG誘變的3、4、5組和8組出現(xiàn)正變菌株的幾率比較高，有118株進(jìn)行了復(fù)篩。由表7可見，通過復(fù)篩所得到的11株高產(chǎn)菌株中以uan783最佳，菌株誘變劑量為UV 15 s+NTG 40 min（最終濃度為 1×10-6mmol/mL），產(chǎn)脂肪酶活性為 2470 U/mL，高于ntg349（s）菌株7.5%。對此菌株分別進(jìn)行了3次分離純化，得到 uan783（s）。

2.2 菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

2.2.1 G55菌株系譜 脂肪酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger G55為出發(fā)菌株，針對于UV和NTG單因素誘變和復(fù)合誘變獲得的8個菌株的系譜如圖3所示。

2.2.2 菌株的斜面?zhèn)鞔a(chǎn)脂肪酶活性比較 分別對于脂肪酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger G55和篩選得到的8個菌株的斜面種子進(jìn)行連續(xù)傳接5代，考察斜面孢子生長情況和產(chǎn)脂肪酶活性。由表8可知，對于篩選得到的菌株連續(xù)5次傳代，所試驗的9株菌傳代斜面生長正常，表面產(chǎn)孢子豐富，經(jīng)過多次誘變最終獲得 uan370（s）和 uan783（s）菌株， 產(chǎn)脂肪酶活力分別為 （2435±62.7）U/mL和（2511±69.4）U/mL，CV 值分別為 2.6%和2.8%，說明該菌株傳代穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性和高產(chǎn)脂肪酶特性。

3 結(jié)論

綜上所述，通過對脂肪酶產(chǎn)生菌Aspergillusniger G55分別采用UV和NTG單因子誘變和復(fù)合誘變，結(jié)合篩選最終獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)脂肪酶菌株 uan783（s）和 uan370（s），產(chǎn)脂肪酶活力分別為2486 U/mL和2410 U/mL，相比原始出發(fā)菌種G55產(chǎn)脂肪酶活力提高32.1%和36.3%。同時，通過傳代試驗，證明獲得的菌株具有高產(chǎn)酶活性和遺傳穩(wěn)定性。

圖3 Aspergillus niger G55菌株系譜