PCSK9抑制劑與低密度脂蛋白水平的研究進(jìn)展

羅群華 黎明江 王 鑫

血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高是冠心病的危險因素，積極降低LDL-C能顯著減少冠心病的致殘率和致死率[1]。大量的臨床試驗(yàn)證明，降低LDL-C沒有下限，對于高風(fēng)險患者更低的LDL-C水平可能更有益[2]。他汀類藥物是目前降低LDL-C水平的重要藥物，但他汀類藥物即使在初始劑量基礎(chǔ)上藥物劑量翻倍，降脂獲益僅增加6%，被認(rèn)為是“他汀的瓶頸”[3]。而且，目前最大耐受的他汀類藥物治療劑量可能不足以充分降低LDL-C水平[4]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/ kexin 9型(PCSK9)抑制劑是降脂藥的新起之秀，能顯著降低LDL-C，并且在家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H)、他汀類藥物不耐受的患者或已經(jīng)服用最大劑量他汀類藥物但仍需要脂質(zhì)減少的患者中可能特別有益。在不同的高風(fēng)險患者組中，針對PCSK9的人單克隆抗體可以將LDL-C水平降低55%～72%[5]。而且，最近已報道PCSK9單克隆抗體在大規(guī)模臨床試驗(yàn)中可顯著降低心血管事件發(fā)生率。本文將對PCSK9分子結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制、PCSK9抑制劑的分類及相關(guān)臨床研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，評價PCSK9抑制劑對降低LDL-C水平的有效性及應(yīng)用的安全性。

一、PCSK9的分子結(jié)構(gòu)

PCSK9是一種肝酶，是由692個氨基酸殘基組成的糖蛋白，在分泌型絲氨酸蛋白酶家族中是第9個被發(fā)現(xiàn)的前蛋白轉(zhuǎn)化酶，是繼LDL受體基因和載脂蛋白B基因后，發(fā)現(xiàn)的第3個可致常染色體顯性高膽固醇血癥的第3個基因。它主要存在于肝臟，可以調(diào)節(jié)LDL-R并因此調(diào)節(jié)LDL-C水平[6]。PCSK9的人22kb基因位于染色體1p32的小臂上，含有12個外顯子和11個內(nèi)含子，其表達(dá)和合成受甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2和肝X受體調(diào)節(jié)[7]。PCSK9最初合成為稱為pro-PCSK9的75kDa可溶性酶原，其含有N-末端信號肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸-組氨酸的C-末端結(jié)構(gòu)域。pro-PCSK9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的自催化裂解，釋放出信號肽、前結(jié)構(gòu)域和60kDa成熟蛋白，緊接著前結(jié)構(gòu)域與成熟蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)到高爾基體并形成成熟的PCSK9，然后在細(xì)胞內(nèi)直接起作用或是被分泌進(jìn)入循環(huán)。

二、PCSK9的作用機(jī)制

正常過程中，LDLR通過載脂蛋白B(apoB)結(jié)合LDL-C，將其內(nèi)吞入肝細(xì)胞內(nèi)并靶向溶酶體，引導(dǎo)其進(jìn)行降解，而且LDL-R可以反復(fù)循環(huán)引入數(shù)百個LDL顆粒進(jìn)入細(xì)胞。而PCSK9通過結(jié)合LDL-R抑制了該循環(huán)，使得LDL-C難以進(jìn)入肝細(xì)胞進(jìn)行降解，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)LDL-C的作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇降低時，PCSK9轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制LDL-R的活性[5]。

1.PCSK9在肝細(xì)胞內(nèi)外參與LDL-C代謝:PCSK9可以在肝細(xì)胞內(nèi)外直接與LDL-R受體結(jié)合從而阻止循環(huán)，也可分泌入血后先與LDL-C顆粒結(jié)合然后再在肝細(xì)胞外作用于LDL-R受體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平降低時，PCSK9開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)。PCSK9可以與LDL-R的表皮生長因子前體同源結(jié)構(gòu)域A結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并與受體一起內(nèi)化[8]。在內(nèi)體中存在的酸性條件下，LDL-R和PCSK9之間的親和力增加。PCSK9的結(jié)合導(dǎo)致LDL-R的構(gòu)象變化，這阻止了LDL-R的正常再循環(huán)。但是，盡管PCSK9進(jìn)入細(xì)胞依賴于LDL-R，但大部分內(nèi)化的PCSK9在細(xì)胞內(nèi)會滯留數(shù)小時[5]。這個時間滯后表明包含有PCSK9和LDL-R的內(nèi)含體不會導(dǎo)致配體和受體立即靶向溶酶體，并且可能存在允許單個PCSK9分子返回表面并作用于新LDL-R的循環(huán)回路。這種相互作用模式(LDL-R導(dǎo)向溶酶體時配體再循環(huán))不同于與含apoB的脂蛋白(LDL-R再循環(huán)時配體導(dǎo)向溶酶體)的典型相互作用。

2.PCSK9在血液中參與LDL-C代謝:當(dāng)PCSK9被分泌入血后，其中的一半可以與LDL顆粒或脂蛋白α顆粒結(jié)合，另一半有的成為高密度脂蛋白(HDL)的一部分，有的游離于血漿中。有趣的是，與LDL結(jié)合的PCSK9大多數(shù)處于完整形式，而自由循環(huán)的PCSK9主要是作為弗林蛋白酶切割的較短蛋白質(zhì)，對LDL-R的親和力可能降低[9]。而血漿中LDL顆粒濃度較PCSK9高出很多，平均每500個天然LDL顆?？梢耘c1個PCSK9蛋白相配對。那么，很容易推測出，存在這樣一種細(xì)胞外隨機(jī)過程，細(xì)胞外結(jié)合有PCSK9的LDL-C顆粒在進(jìn)入肝細(xì)胞時，PCSK9與LDL-R結(jié)合，介導(dǎo)LDL-C及LDL-R一起靶向溶酶體，但是結(jié)合有PCSK9的LDL-C顆粒幾乎500個里面只有1個。不難想像，肝臟就是這么調(diào)節(jié)LDL并最終控制全身膽固醇體內(nèi)平衡。這也為單個LDL-R分子在失活前能夠循環(huán)數(shù)百次提供了合理的解釋[10]。這個過程依賴于復(fù)雜和精細(xì)的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制，如甾醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和肝X受體轉(zhuǎn)錄途徑。

3.PCSK9在動脈斑塊中參與LDL-C代謝:PCSK9可自由循環(huán)通過動脈斑塊中的細(xì)胞外空間，此外，斑塊巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可以分泌PCSK9并可以受其作用。這意味著在正常情況下，動脈粥樣硬化細(xì)胞中的LDL-R表達(dá)受PCSK9局部濃度的調(diào)節(jié)[11]。與肝臟不同的是，斑塊在有效攝取脂蛋白膽固醇后，可能誘導(dǎo)斑塊局部進(jìn)展或不穩(wěn)定?？梢栽O(shè)想，治療性PCSK9抑制可以在斑塊細(xì)胞中產(chǎn)生LDL-R的上調(diào)，從而導(dǎo)致粥樣斑塊中膽固醇積累的增加。

PCSK9對動脈粥樣硬化的影響包括對LDL代謝的全局影響，對動脈粥樣硬化病變內(nèi)LDL代謝的局部影響，以及對其他致動脈粥樣硬化機(jī)制如炎癥的影響。動脈粥樣硬化是動脈壁的慢性炎性疾病，其特征在于內(nèi)皮細(xì)胞活化、單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的積聚。動脈粥樣硬化病變是位點(diǎn)特異性的，并且在低切應(yīng)力區(qū)域優(yōu)先發(fā)展。低切應(yīng)力增加人和小鼠內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞PCSK9的表達(dá)，PCSK9表達(dá)與單核細(xì)胞趨化性和低切應(yīng)力區(qū)黏附之間的關(guān)聯(lián)表明PCSK9與炎癥之間呈相關(guān)性[12]。PCSK9這種在血管壁中的直接促炎作用，可能通過作用于LDL-R相關(guān)蛋白1(LRP1)，對斑塊巨噬細(xì)胞的炎癥方面發(fā)揮強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，LRP1的缺失可以誘導(dǎo)炎癥，而斑塊中的PCSK9可以降低LRP1水平[13]。那么斑塊中的高濃度PCSK9有促炎作用，這與其在斑塊中下調(diào)LDL-R、降低LDL-C的作用恰恰相反。因此，通過單克隆抗體對PCSK9的治療性阻斷可能具有正面和負(fù)面效應(yīng)的組合，盡管其對血漿LDL-C減少有巨大效益，但在臨床研究中到底獲益如何還需進(jìn)一步評估。

三、PCSK9抑制劑

PCSK9抑制劑通過阻斷PCSK9對LDL-R的降解，降低循環(huán)LDL-C水平。根據(jù)其作用機(jī)制不同，可分為3類：①單克隆抗體或模擬抗體蛋白物：直接抑制PCSK9蛋白與LDL-R結(jié)合;②反義寡核苷酸或小干擾RNA(siRNA)：通過基因沉默作用來抑制 PCSK9 轉(zhuǎn)錄合成;③作用于PCSK9蛋白催化部位的低分子肽類：這些肽類可與PCSK9蛋白的催化部位結(jié)合使其發(fā)生變構(gòu)，進(jìn)而影響到 PCSK9 蛋白與LDL-R結(jié)合。

1.PCSK9抑制劑-單克隆抗體:在針對PCSK9開發(fā)的幾種單克隆抗體中，evolocumab和alirocumab這兩種已被批準(zhǔn)用于臨床。兩者都是皮下使用的全人單克隆抗體。

(1)evolocumab：evolocumab的給藥劑量以每2周140mg或每月420mg。這兩種劑量均可以使血漿LDL-C水平產(chǎn)生相似程度的降低[14]。在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，無論是作為單藥治療，還是加入他汀類藥物治療，還是對他汀類藥物不耐受或給予雜合子FH的患者，該劑量的evolocumab均可使血漿LDL-C水平降低約60%[15]。總體而言，血漿LDL-C水平的降低在不同的臨床亞組中高度一致。此外，無論基線血漿PCSK9水平如何，evolocumab均可降低LDL-C水平。

(2)alirocumab:多種alirocumab給藥方案已用于Ⅲ期臨床試驗(yàn)。一種方案是基于血漿LDL-C水平降低程度的效價劑量：患者從每2周75mg alirocumab開始，然后如果LDL-C水平≥70mg/dl，則劑量將增加至每2周150mg。一般來說，這種方法可使LDL-C水平降低45%～50%，無論是單藥治療，還是加用他汀類藥物治療或?qū)τ谒☆愃幬锊荒褪艿幕颊遊16]。在這些試驗(yàn)中，alirocumab的最大劑量，每2周150mg，血漿LDL-C水平降低約60%，這與evolocumab所示的相似。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，每4周300mg的alirocumab方案將血漿LDL-C水平降低55%～60%。數(shù)據(jù)顯示，在雜合子FH患者中，alirocumab治療使LDL-C水平降低約40%～60%。在純合子FH患者中，根據(jù)患者的基因型，用alirocumab治療觀察到的LDL-C水平下降范圍為7%～64%不等[17]。

(3)單克隆抗體可升高循環(huán)中PCSK9水平:針對PCSK9的兩種目前可用的抗體，其在循環(huán)中與PCSK9以約1∶1的化學(xué)計(jì)量比結(jié)合并禁止其與LDLR結(jié)合，從而產(chǎn)生導(dǎo)致LDL-R大量積累且PCSK9缺陷的狀態(tài)。在肝細(xì)胞膜上，LDL顆粒加速清除，血漿LDL-C水平大幅下降。皮下注射75～150mg的alirocumab或140～420mg的evolocumab引入了大量過量(相對于目標(biāo)超過100∶1)的抗體，在給藥的短短幾個小時內(nèi)捕獲所有循環(huán)的PCSK9并將在接下來的幾天捕獲所有新分泌的PCSK9[18]。報告治療患者中幾乎沒有游離PCSK9的數(shù)據(jù)，也就未能全面反映注射抗體后循環(huán)中PCSK9的情況，因?yàn)檫@種抑制PCSK9的方法實(shí)際上導(dǎo)致血液中靶標(biāo)的大量積累。使用靶向單克隆抗體的患者PCSK9的總血漿濃度平均增加10倍，而在某些個體中甚至增加20倍[19]。這種極端積累有不同的解釋：①因?yàn)镻CSK9不再能夠獲得更有效的LDL-R途徑，PCSK9的清除速度之前減慢許多；②注射后幾天新產(chǎn)生的PCSK9將被捕獲，并與治療性抗體混合在循環(huán)中；③也有可能是肝臟對PCSK9分泌的上調(diào)。

單克隆抗體治療誘導(dǎo)血管中PCSK9積聚作為免疫復(fù)合物的一部分，這一事實(shí)在評估PCSK9抑制劑的耐藥性時，可用作第一步診斷標(biāo)志物，確認(rèn)升高的血漿PCSK9將意味著抗體已經(jīng)達(dá)到抗性作用，而正常水平的PCSK9將表明患者依從性、注射技術(shù)問題或者存在對循環(huán)中抗體的自由分布的皮膚病學(xué)、淋巴系統(tǒng)或系統(tǒng)性障礙的問題[19]。最后，因?yàn)榻?0%的PCSK9存在于LDL顆粒上，所以假定通過注射單克隆抗體產(chǎn)生的大部分免疫復(fù)合物將與LDL結(jié)合是合理的。這是否與干預(yù)的生化或臨床功效相關(guān)尚不清楚，但可以作為研究工具來識別攜帶PCSK9的LDL亞群。

2.PCSK9抑制劑的安全性:到目前為止，所有2期和3期研究都強(qiáng)烈提示alirocumab和evolocumab的安全性極佳，包括達(dá)到LDL-C水平<15mg/dl的試驗(yàn)參與者。最常見的治療后出現(xiàn)的不良反應(yīng)為局部注射反應(yīng)，其他少見的包括類固醇激素和維生素水平的變化，還有神經(jīng)認(rèn)知障礙以及感染和癌癥的風(fēng)險[20]。目前使用PCSK9抑制劑的安全性數(shù)據(jù)在開放標(biāo)簽延伸試驗(yàn)中延長至52～78周[21]。在FOURIER的開放標(biāo)簽延伸試驗(yàn)中將繼續(xù)監(jiān)測極低LDL-C水平的長期安全性。

3.PCSK9抑制劑和他汀類藥物:根據(jù)臨床試驗(yàn)證據(jù)，對于正在服用他汀類藥物和(或)依澤替米貝在內(nèi)的最大耐受性口服治療，LDL-C水平仍達(dá)70mg/dl的高風(fēng)險患者，推薦使用PCSK9抑制劑降低LDL-C。眾所周知，服用他汀類藥物的患者中有5%～20%會出現(xiàn)他汀類藥物相關(guān)的肌肉癥狀[22]，這可能導(dǎo)致他汀類藥物強(qiáng)度不理想。PCSK9抑制劑和他汀類藥物有一些相似之處和一些重要差異。在最高劑量下，他汀類和PCSK9抑制劑均使血漿LDL-C水平降低約60%。他汀類藥物傾向于比PCSK9抑制劑更能降低血漿甘油三酯水平(25%～35%∶15%)[20]。不過，在降低血漿脂蛋白B的水平上，這兩者沒有差異。但是，PCSK9抑制劑使血漿脂蛋白A的水平降低約25%，而他汀類藥物不會降低，甚至可能增加血漿脂蛋白A水平。相比之下，他汀類藥物似乎具有抗炎作用，例如他汀類藥物治療后血漿中C反應(yīng)蛋白水平可降低，而PCSK9抑制劑對通過高敏感度檢測測得的C反應(yīng)蛋白水平?jīng)]有影響[23]。除了LDL-C水平之外，PCSK9抑制劑和他汀類藥物對其他參數(shù)的不同作用是否會轉(zhuǎn)化為臨床風(fēng)險降低的差異，仍然是一個尚未解決的問題。

4.PCSK9抑制劑可顯著降低ASCVD事件風(fēng)險:許多前瞻性隊(duì)列研究、自然隨機(jī)化研究和隨機(jī)臨床試驗(yàn)證實(shí)血管絕對暴露于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與心血管事件的風(fēng)險之間存在對數(shù)線性關(guān)聯(lián)[23]。臨床試驗(yàn)已證明，PCSK9抑制劑可以使心血管事件減少，特別是對于近期急性冠狀動脈綜合征、多支冠狀動脈疾病或外周動脈疾病的患者。降低LDL-C可能沒有下限，當(dāng)LDL-C顯著降低至<20mg/dl的水平時，常伴隨著甚至更低的動脈粥樣硬化心血管疾病事件發(fā)生率[24]。用完全人PCSK9單克隆抗體降低頑固性高LDL-C，可能有更有利的安全性特征。

大量的動脈壁成像研究已經(jīng)證明了降脂藥可以減輕動脈粥樣硬化斑塊的負(fù)荷和延緩其進(jìn)展。有證據(jù)表明，當(dāng)LDL-C水平低于70mg/dl時，動脈粥樣硬化斑塊會出現(xiàn)倒退。GLAGOV研究評估了evolocumab對斑塊成分的影響。與繼續(xù)他汀類單一療法組比較，用evolocumab和他汀類藥物療法組合治療的患者中可以觀察到斑塊鈣化的增加[25]。這表明，強(qiáng)化脂質(zhì)降低會導(dǎo)致斑塊消退和鈣化，這可能會穩(wěn)定斑塊并減少心血管事件。

四、臨床心血管試驗(yàn)

迄今為止，3項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的心血管預(yù)后試驗(yàn)評估了PCSK9抑制劑的療效。

1.FOURIER試驗(yàn)：evolocumab的FOURIER試驗(yàn)是PCSK9抑制劑首次成功完成的心血管試驗(yàn)[20]。共有27564例患有臨床明顯ASCVD的患者，特別是具有心肌梗死(myocardial infarction，MI)、非出血性卒中或癥狀性外周動脈疾病病史的患者，參加了該試驗(yàn)。在試驗(yàn)過程中，與安慰劑比較，evolocumab治療顯著降低了主要終點(diǎn)風(fēng)險的15%(HR=0.85,95%CI：0.79～0.92)和主次要終點(diǎn)降低20%(HR=0.80,95%CI：0.73～0.88)。致死性或非致死性MI、致死性或非致死性腦卒中和冠狀動脈血運(yùn)重建的風(fēng)險顯著降低(21%～27%)。evolocumab的臨床益處在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)亞組中基本一致。重要的是，基線LDL-C水平亞組的益處也是一致的，包括基線LDL-C水平<70mg/dl的患者，其中與安慰劑比較，evolocumab將LDL-C降低至21mg/dl并對于心血管風(fēng)險、死亡、MI或腦卒中等風(fēng)險降低30%(HR=0.70,95%CI：0.48～1.01)。

2.SPIRE-1和SPIRE-2試驗(yàn)：對于bococizumab的SPIRE-1和SPIRE-2試驗(yàn)的結(jié)果與FOURIER試驗(yàn)的結(jié)果是同時提出的。在認(rèn)識到由于中和抗體的開發(fā)，人源化但非完全人單克隆抗體bococizumab對血漿LDL-C水平降低的影響不能持續(xù)時，申辦者提前終止了這些試驗(yàn)。

3.ODYSSEY結(jié)果試驗(yàn)：鑒于結(jié)果尚未公布，2018年3月美國ACC科學(xué)會議上提出的ODYSSEY結(jié)果試驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)視為初步結(jié)果。在住院治療MI或不穩(wěn)定型心絞痛后1～12個月，共有18924例患者參加了ODYSSEY試驗(yàn)。在試驗(yàn)過程中，與安慰劑比較，alirocumab顯著降低了主要終點(diǎn)的風(fēng)險15%(HR=0.85,95%CI：0.78～0.93，P=0.003)。alirocumab對復(fù)合終點(diǎn)的各個組成部分(包括冠心病死亡)的影響是方向一致的。值得注意的是，在ODYSSEY結(jié)果試驗(yàn)中，ACS與隨機(jī)化之間的時間間隔要短于FOURIER試驗(yàn)。但有證據(jù)表明，ACS患者在前面的降脂試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的事件曲線的早期差異可能與降低C反應(yīng)蛋白水平相關(guān)，其影響可能比LDL-C水平降低更大。PCSK9抑制劑可有效降低LDL-C水平，但對C反應(yīng)蛋白水平?jīng)]有影響。

盡管近年來取得了重大進(jìn)展，但PCSK9抑制劑作為降低ASCVD風(fēng)險的策略仍處于起步階段。目前，PCSK9抑制劑用于ASCVD一級預(yù)防的用途僅限于那些患有FH的患者。尚未確定早期和侵襲性LDL-C降低與已證實(shí)的療法(PCSK9抑制劑)是否可以預(yù)防年輕、有風(fēng)險的患者的動脈粥樣硬化。除了目前可用的單克隆抗體外，還開發(fā)了每年1次的疫苗和每年2次的皮下注射，這兩種方法都更方便。 Inclisiran是一種靶向PCSK9 mRNA的小干擾RNA，導(dǎo)致肝臟中PCSK9合成減少，似乎接下來有希望降低LDL-C的新熱點(diǎn)。在第1天和第90天給予300mg劑量后，然后每6個月注射1次，inclisiran可以將LDL-C水平降低至53%。LDL-C的這種減少類似于每2～4周施用的alirocumab和evolocumab所實(shí)現(xiàn)的減少。鑒于其與單克隆抗體比較具有根本不同的作用機(jī)制，使用該藥劑計(jì)劃的更大規(guī)模的ASCVD結(jié)果，隨機(jī)臨床試驗(yàn)是必不可少的。

五、展 望

綜上所述，PCSK9時代的心血管風(fēng)險預(yù)防領(lǐng)域已經(jīng)開始到來。即將發(fā)生的影響可能是在某些臨床實(shí)踐指南中重新引入LDL-C效力監(jiān)測，并建議甚至更普遍的更嚴(yán)格的目標(biāo)LDL-C水平。PCSK9抑制劑現(xiàn)已被證明是臨床醫(yī)生用于治療血脂異常的有效補(bǔ)充。通過使血漿LDL-C水平降低約60%，顯著降低主要血管事件的風(fēng)險，除注射部位反應(yīng)外幾乎無其他不良反應(yīng)。具有高ASCVD負(fù)擔(dān)的患者發(fā)生主要血管事件的風(fēng)險會增加，這類人群會受益于PCSK9抑制的相對和(或)絕對風(fēng)險降低。在PCSK9抑制試驗(yàn)中觀察到的臨床益處發(fā)生在將血漿LDL-C降低至約20mg/dl的水平，表明應(yīng)采用更具侵襲性的LDL-C靶標(biāo)。如果PCSK9 siRNA抑制劑的臨床療效和安全性得到驗(yàn)證，這些療法可以提供更早和更容易干預(yù)治療血脂異常的機(jī)會，并可能在很大程度上根除冠心病。