乙型肝炎病毒X基因在涎腺腺樣囊性癌中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

謝玲 王衛(wèi)紅 許彪 劉嶼

1.新津縣人民醫(yī)院口腔科，成都 611403；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650031

近年來，隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多的研究表明，全球8%～17%的腫瘤與病毒或細(xì)菌等慢性感染有關(guān)，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）與肝癌[1]。然而HBV可感染身體其他部位[2-3]，在這些器官、組織和細(xì)胞中均可檢測到HBV DNA。這說明HBV嗜肝性不十分嚴(yán)格，有一定的泛嗜性。研究[4-5]表明唾液中也可檢測到HBV，涎腺組織也易感染HBV[6]。乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B-virus X gene，HBX）對肝癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，涎腺組織也易感染HBV，推測HBX在涎腺腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）中可能存在表達(dá)，且對ACC的發(fā)生、發(fā)展可能起著重要作用。本研究利用臨床手術(shù)中保留的ACC新鮮組織標(biāo)本，探討HBX在ACC中的表達(dá)及其意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本和方法

選取2008年6月—2012年10月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科的涎腺腫瘤患者為研究對象。經(jīng)患者同意后，行HBV血清學(xué)檢查。將臨床手術(shù)中切取的部分新鮮涎腺腫瘤標(biāo)本放入-196 ℃液氮罐中備用，根據(jù)血清學(xué)檢查和術(shù)后病理結(jié)果將患者分為ACC組和對照組（涎腺腺淋巴瘤組），每組14例。每組中男6例，女8例，年齡26～53歲，平均42.5歲。無論血清學(xué)結(jié)果中HBeAg是陽性或陰性，以HBeAb陽性為HBV攜帶者或曾感染者[7-8]。

1.2 主要試劑

乙型肝炎病毒X抗體（Abcam公司，英國），通用型免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），總RNA提取試劑和Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

取凍存的部分涎腺腫瘤組織行石蠟包埋，石蠟塊作4 μm切片供免疫組織化學(xué)染色。SP免疫組織化學(xué)法檢測涎腺腫瘤標(biāo)本中HBX的表達(dá)，HBX抗體濃度配制為原濃度的1/200倍。以PBS代替一抗作為陰性對照。以腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判斷為陽性。在相同光源強(qiáng)度下，每張切片隨機(jī)選取10個視野，每個視野下選取5張圖片（×400），保存圖像格式為TIFF。應(yīng)用Image-Pro plus 6.0軟件對圖像進(jìn)行分析，錄制Macro中測量參數(shù)包括光密度矯正、平均光密度、面積最小值。取得每個視野的平均光密度值。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測HBX mRNA的表達(dá)

取凍存的部分涎腺腫瘤組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參，PCR反應(yīng)所用引物設(shè)計(jì)如下。HBX上游引物序列為5’-GGAAGACACAATGAAGAAT-3’，下游引物序列為5’-CACCACAGGAATATCAGT-3’，產(chǎn)物大小為169 bp；β-actin上游引物序列為5’-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3’，下游引物序列為5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGT-3’，產(chǎn)物大小為172 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，55 ℃ 45 s ，72 ℃ 30 s，共30循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像。應(yīng)用Gel-Pro analyzer 4.0軟件對PCR圖像進(jìn)行分析，分析涎腺腫瘤標(biāo)本中HBX mRNA表達(dá)（光密度值）。分析前將圖片色彩進(jìn)行反轉(zhuǎn)，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對于兩組中HBX的表達(dá)率，非參數(shù)數(shù)據(jù)加權(quán)后，采用Crosstabs卡方分析；對于兩組中HBX的表達(dá)強(qiáng)度，其獨(dú)立樣本定量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

每組中抗HBeAb陽性和陰性者各7例（表1）。28例涎腺腫瘤組織中，14例HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性表達(dá)10例，另14例HBeAb陰性涎腺腫瘤中HBX陽性表達(dá)1例，HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性率明顯高于HBeAb陰性涎腺腫瘤（χ2=12.13，P＜0.01）。而ACC組和對照組中HBX陽性率無明顯差異（χ2=1.348，P=0.246）（表1）。HBX大多數(shù)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，小部分表達(dá)于胞核內(nèi)。HBX免疫組織化學(xué)染色為胞漿棕黃染色（圖1），HBX在ACC中表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于涎腺腺淋巴瘤，其平均光密度值分別為0.238±0.022、0.157±0.021，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.909，P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示HBX mRNA水平在ACC中高于涎腺腺淋巴瘤，其平均光密度值分別為0.171±0.046、0.075±0.006，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.437，P=0.029）。

表1 HBX在不同涎腺腫瘤組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of HBX in different salivary tissues n=14

圖1 HBX在ACC和涎腺腺淋巴瘤中的表達(dá) SP × 400Fig 1 Expression of HBX in ACC and Warthin tumor SP × 400

3 討論

HBX基因是HBV 4個開放讀碼框架（open reading frame，ORF）中最小的一個編碼。HBX主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，小部分位于細(xì)胞核內(nèi)。胞質(zhì)中的HBX參與調(diào)控多條影響細(xì)胞生存、分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而胞核中的HBX具有反式激活作用，HBX蛋白的反式激活功能區(qū)內(nèi)有與p53結(jié)合的位點(diǎn)。HBX與p53結(jié)合后，胞質(zhì)中的p53進(jìn)入細(xì)胞核受阻，使p53蛋白進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮正常負(fù)調(diào)節(jié)功能的過程受影響，導(dǎo)致p53基因的負(fù)調(diào)節(jié)功能失活，從而抑制p53誘導(dǎo)的凋亡，并與HBX一起反式激活，從而抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，二者長期相互作用導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生改變而最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。

目前國內(nèi)外有關(guān)HBX基因的研究，多源于HBV相關(guān)性肝癌，而對于HBX基因在人體其他組織中的研究則較少[11]。以往研究[4-6]表明HBV嗜肝性不十分嚴(yán)格，有一定的泛嗜性，HBV對涎腺組織有較強(qiáng)的親和力，唾液中HBV可源于受染的唾液腺組織。由于唾液中存在著HBV，可能導(dǎo)致口腔上皮細(xì)胞損害及炎癥的發(fā)生，從而引起口腔腫瘤的發(fā)生。Takata等[12]認(rèn)為HBV感染與口腔良性腫瘤存在相關(guān)性。筆者研究表明HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性率明顯高于HBeAb陰性涎腺腫瘤（P＜0.01），初步說明HBX在涎腺腫瘤的表達(dá)與HBV感染有關(guān)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示HBX在ACC和涎腺腺淋巴瘤中存在表達(dá)，平均光密度值分別為0.238±0.022、0.157±0.021，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示：ACC組和對照組HBX mRNA平均光密度值分別為0.171±0.046、0.075±0.006，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029），HBX在ACC中表達(dá)明顯高于對照組。說明HBX在ACC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演重要的角色。但本研究結(jié)果同時顯示，ACC組和對照組中HBX陽性率無明顯差異（P=0.246），可能是因?yàn)楸窘M樣本量僅為28例，且沒有正常涎腺組織的對照，因此兩組間HBX陽性率無明顯差異并不能說明HBV感染與涎腺腫瘤無關(guān)。有1例HBeAb陰性ACC組織中HBX陽性表達(dá)，可能存在既往HBV感染，這需要進(jìn)一步大量臨床資料研究證實(shí)。

初步研究表明HBX在ACC中存在表達(dá)，防治HBV感染，也許可阻斷癌基因HBX的表達(dá)，促進(jìn)涎腺腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而關(guān)于HBV感染與ACC或涎腺腫瘤的關(guān)系，還需進(jìn)一步研究探討。

[1]Yang JD, Roberts LR. Epidemiology and management of hepatocellular carcinoma[J]. Infect Dis Clin North Am, 2010,24(4):899-919.

[2]Chen LZ, Fan XG, Gao JM. Detection of HBsAg, HBcAg,and HBV DNA in ovarian tissues from patients with HBV infection[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(35):5565-5567.

[3]Komatsu H, Inui A, Sogo T, et al. Tears from children with chronic hepatitis B virus (HBV)infection are infectious vehicles of HBV transmission: experimental transmission of HBV by tears, using mice with chimeric human livers[J]. J Infect Dis, 2012, 206(4):478-485.

[4]Kidd-Ljunggren K, Holmberg A, Bl?ckberg J, et al. High levels of hepatitis B virus DNA in body fl uids from chronic carriers[J]. J Hosp Infect, 2006, 64(4):352-357.

[5]Meo SA, Assad AA, Sanie FM, et al. Transmission of hepatitis-B virus through salivary blood group antigens in saliva[J]. J Coll Physicians Surg Pak, 2010, 20(7):444-448.

[6]Chen L, Liu F, Fan X, et al. Detection of hepatitis B surface antigen, hepatitis B core antigen, and hepatitis B virus DNA in parotid tissues[J]. Int J Infect Dis, 2009, 13(1):20-23.

[7]Sogut I, Hatipoglu I, Kanbak G, et al. Monoclonal antibodies speci fi c for hepatitis B e antigen and hepatitis B core antigen[J]. Hybridoma: Larchmt, 2011, 30(5):475-479.

[8]Kaijima H, Yukimasa N, Sugano E, et al. Analysis of the relevance of the mutations of the precore and basic core promoter in HBV genome with the DNA amount of HBV viremia[J]. Rinsho Byori, 2009, 57(4):332-337.

[9]Zhang SJ, Chen HY, Chen ZX, et al. Possible mechanism for hepatitis B virus X gene to induce apoptosis of hepatocytes[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(28):4351-4356.

[10]Park SG, Min JY, Chung C, et al. Tumor suppressor protein p53 induces degradation of the oncogenic protein HBX[J].Cancer Lett, 2009, 282(2):229-237.

[11]Rawat S, Clippinger AJ, Bouchard MJ. Modulation of apoptotic signaling by the hepatitis B virus X protein[J]. Viruses,2012, 4(11):2945-2972.

[12]Takata Y, Takahashi T, Fukuda J. Prevalence of hepatitis virus infection in association with oral diseases requiring surgery[J]. Oral Dis, 2002, 8(2):95-99.