家蠶滯育激素受體體外上調(diào)下游海藻糖酶基因的表達(dá)

沈興家，王力剛，韋博尤，朱 娟，唐順明，趙巧玲

(1.江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

(3.廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530007)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和模式生物，家蠶滯育機(jī)理研究一直受到學(xué)界的關(guān)注并取得了重要進(jìn)展［1－3］.家蠶滯育是由滯育激素(DH)與家蠶滯育激素受體(BmDHR)結(jié)合，通過抑制環(huán)鳥苷酸(cGMP)的合成，上調(diào)下游海藻糖酶基因(Bmtre)的表達(dá)，從而促進(jìn)海藻糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，滯育發(fā)生［4－6］.根據(jù)生物信息學(xué)分析，家蠶滯育激素受體基因有5種剪接方式，即轉(zhuǎn)錄成5種mRNA，其中Bmdhr－1與Bmdhr－2編碼的氨基酸序列相同，因此共編譯4種蛋白質(zhì) BmDHR－1，－3，－4，－5［7］.其中，BmDHR－1是一種 G 蛋白偶聯(lián)受體，能特異性結(jié)合滯育激素，偶聯(lián)Gq蛋白，通過鈣離子和蛋白激酶C參與激活下游滯育信號(hào)，使家蠶卵巢細(xì)胞內(nèi)的海藻糖酶活性增高［4］.

海藻糖酶(EC3.2.1.28)是昆蟲體內(nèi)重要的糖酶，也是昆蟲體內(nèi)唯一能夠水解海藻糖的酶類，它能專一性地將1分子海藻糖水解為2分子的葡萄糖［8］，產(chǎn)生的葡萄糖最終作為昆蟲細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的原料［9－11］.在二化性家蠶中，受滯育信號(hào)的影響，蛹體表現(xiàn)出激活卵巢海藻糖酶的表達(dá)活性［12］，促進(jìn)血液中的海藻糖轉(zhuǎn)化［6，13－14］.伴隨著滯育的啟動(dòng)，糖原被轉(zhuǎn)化成多元醇，如具有冷凍保護(hù)作用的山梨醇和甘油［15］.但是，在分子水平上驗(yàn)證BmDHR對(duì)下游海藻糖酶基因(Bmdhr)的調(diào)控作用則尚未見報(bào)道.文中以pcDNA3.1載體為骨架構(gòu)建真核表達(dá)載體，用家蠶核型多角體病毒的ie－1啟動(dòng)子啟動(dòng)Bmdhr基因的表達(dá)［16］，利用家蠶細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，在滯育激素的刺激下體外分析海藻糖酶啟動(dòng)子的活性，驗(yàn)證BmDHR的功能.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與主要試劑

家蠶二化性品種“秋豐”，宿主菌E.coli Top10菌株、pcDNA3.0載體、pMD－ie－1質(zhì)粒(ie－1啟動(dòng)子片段長度為 646 bp，兩端分別含 BglⅡ和BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn))［16］、p3Z －Bmtre－luc表達(dá)質(zhì)粒，p3Z －Bmtre質(zhì)粒［17］，以及包含 Bmdhr基因 cDNA 的各種質(zhì)粒(pMD18 － Bmdhr)［7］均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存.

各種限制性內(nèi)切酶、ExTaq酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒載體pMD18－T和pGL3.0 basic載體等購自寶生物工程(大連)有限公司.TC－100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin試劑購自Invitrogen公司;熒光素酶檢測(cè)試劑盒(E4030)購自Promega公司.滯育激素(MW:2731.01)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成［18］.

1.2 Bmdhr cDNA片段克隆

根據(jù)家蠶滯育激素受體基因Bmdhr mRNA－1，mRNA －3，mRNA －4，mRNA －5 序列，分別設(shè)計(jì)上游引物Bmdhr－F:GGTACCATGAACTCAGAAACAATAAACGA(含BamHⅠ位點(diǎn));4個(gè)下游引物分別為:Bmdhr －1－R AAGCTTGATTGCCATCTGAGTAGC(含 HindⅢ位點(diǎn)，下同)，Bmdhr－3－R AAGCTTGACGGCGGTATCATTG，Bmdhr－4－R AAGCTTATTGATTGCCATCTGAGTAGC，Bmdhr－5－R AAGCTTCCTAAATGTATTGTTTGTAAGC.其合成、測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

分別以各種包含Bmdhr cDNA的質(zhì)粒pMD18－Bmdhr為模板用上述上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?95℃ 3 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min.以1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

將上述測(cè)序正確的各種PCR片段經(jīng)BamHⅠ－BglⅡ雙酶解后，分別連接到經(jīng)同樣雙酶解的pMD－ie－1質(zhì)粒中，在top 10菌株中篩選重組質(zhì)粒pMD－ie1－Bmdhr;再分別經(jīng)BamHⅠ－HindⅢ雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物片段ie－1－Bmdhr，分別連接到經(jīng)同樣 BamHⅠ －HindⅢ雙酶切的 pcDNA3.0載體中，構(gòu)建BmDHR表達(dá)載體pcDNA－ie1－Bmdhr，并進(jìn)行酶切鑒定.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

家蠶細(xì)胞BmN參照文獻(xiàn)［19］的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)傳代.細(xì)胞用24孔板培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)染.在100 μL反應(yīng)體系中，分別用5 μL Lipofectin包埋1 μg表達(dá)質(zhì)粒與p3Z－Bmtre－luc報(bào)告質(zhì)粒制成轉(zhuǎn)染液.轉(zhuǎn)染前傾去舊培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基輕洗滌2次，加1 mL無血清TC－100培養(yǎng)基，加入100 μL轉(zhuǎn)染液混勻，溫育細(xì)胞4～5 h，除去舊培養(yǎng)基，加入1mL含100nmol/L滯育激素濃度和10%FBS的TC－100培養(yǎng)基.以p3Z－Bmtre－luc報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5 熒光素酶活性分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，5 000 g 4℃離心5 min收集細(xì)胞，去上清液，按照E4030試劑盒(Promega)的說明裂解細(xì)胞.加100 μL熒光素酶底物于測(cè)定管中，然后加入20 μL的細(xì)胞裂解液混勻，在LuminoMeter 20/20熒光光度計(jì)上測(cè)定熒光素酶(LUC)活性(2 s延遲，10 s讀數(shù))，以相對(duì)熒光強(qiáng)度單位(relative luminescence unit，RLU)表示［18，20］.平行測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，以校正報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性值［16］.使用SPSS軟件進(jìn)行差異性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmdhr基因cDNA的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

家蠶滯育激素受體基因cDNA的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)測(cè)序與報(bào)道的基因序列一致，可用于后續(xù)研究.

各重組質(zhì)粒pMD－Bmdhr經(jīng)M13引物雙向測(cè)序后，得到的Bmdhr cDNA序列與預(yù)期序列一致，Bmdhr－1，－3，－4，－5分別為1311，810，1104和804 bp，表明已得到正確的目的片段，可以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.對(duì)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－ie1－Bmdhr－1，－3，－4，－5進(jìn)行 BamHⅠ －HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果正確(圖略)，可用于真核表達(dá).

2.2 BmDHR對(duì)Bmtre基因啟動(dòng)子活性的影響

將上述構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－ie1－Bmdhr1，pcDNA －ie1－Bmdhr3，pcDNA －ie1－Bmdhr4，pcDNA－ie1－Bmdhr5分別與 p3Z－Bmtreluc報(bào)告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，以p3Z－Bmtreluc報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陽性對(duì)照，載體p3ZBmtre轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照，4～5 h后用含100 nM滯育激素的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測(cè)LUC活性，并經(jīng)空白對(duì)照和總蛋白量矯正.結(jié)果如圖1所示，在100 nM的滯育激素影響下，表達(dá)Bm-DHR－1、－3、－4和－5載體共轉(zhuǎn)染分別使海藻糖酶基因啟動(dòng)子的活性提高2.4，2.8，1.7，2.2倍，達(dá)到顯著水平(F=12.041，P=0.026＜0.05).

2.3 BmDHR－1與BmDHR－5共表達(dá)分析

將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－ie－1－Bmdhr－1，pcDNA－ie－1－Bmdhr－5 DNA 按不同摩爾比(0∶4，1∶1，3∶1，1∶3，4∶0)與 p3Z － Bmtre－luc報(bào)告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，以p3Z－Bmtre－luc報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陽性對(duì)照，載體p3Z－Bmtre轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照，4～5 h后用含100 nM滯育激素的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測(cè)LUC活性，并經(jīng)空白對(duì)照和總蛋白量矯正，結(jié)果如圖2所示.在100 nM的滯育激素作用下，對(duì)照組海藻糖酶啟動(dòng)子活性為11 504.33±500.67，圖2顯示不同摩爾比的 Bmdhr－1/BmDHR －5(1∶1，3∶1，1∶3)分別使海藻糖酶啟動(dòng)子的活性提高3.1，3.5，2.3倍，達(dá)到顯著水平(F=8.465，P=0.029 ＜0.05).其中，摩爾比為1∶1和3∶1時(shí)，海藻糖酶啟動(dòng)子的活性極顯著高于BmDHR－1或BmDHR－5單獨(dú)作用(F=58.951，P=0.001 55 ＜ 0.01;F=107.364，P=0.00049＜0.01;F=29.472，P=0.00558＜0.01;F=60.9872，P=0.00145 ＜0.01);比例為1∶3 時(shí)與二者單獨(dú)作用時(shí)相當(dāng)，差異不顯著(以與BmDHR－5單獨(dú)作用的差異分析為例，F(xiàn)=7.099，P=0.057＞0.05).

圖2 不同摩爾比的BmDHR－1/BmDHR－5對(duì)海藻糖酶啟動(dòng)子活性的影響Fig.2 Effects of different Mole ratio of BmDHR －1/BmDHR－5 on Bmtre promoter activities

3 結(jié)論

文中分別構(gòu)建了家蠶4個(gè)滯育激素受體Bm-DHR－1，－3，－4，－5的表達(dá)質(zhì)粒，利用家蠶細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，體外分析了家蠶不同滯育激素受體或其組合對(duì)海藻糖酶基因啟動(dòng)子活性的影響.由于BmDHR必須與DH結(jié)合才能調(diào)控下游基因的表達(dá)［4－6］，因此在家蠶細(xì)胞共轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒后的培養(yǎng)基中加入人工合成的家蠶DH(100 nM).

在滯育激素作用下，Bmdhr－1、－3、－4和 －5分別單獨(dú)表達(dá)時(shí)，均上調(diào)家蠶Bmtre啟動(dòng)子的活性，證明BmDHR能上調(diào)下游基因Bmtre的表達(dá).但是，4種BmDHR對(duì)Bmtre上調(diào)倍數(shù)存在差異，由高到低依次為BmDHR－3、BmDHR－1、BmDHR－5、BmDHR－4，生物信息學(xué)分析顯示4個(gè)BmDHR的一級(jí)氨基酸序列同源性很高，前5次跨膜結(jié)構(gòu)完全一致［7］，表明BmDHR調(diào)節(jié)海藻糖酶啟動(dòng)子的活性部位可能在前5次跨膜區(qū)域.

G蛋白偶聯(lián)受體可以通過組成二聚體發(fā)揮作用，其中包括同源二聚體和異源二聚體兩種類型［21］.形成二聚體的G蛋白偶聯(lián)受體在功能上的變化也有不同，有的會(huì)增加活性，有的會(huì)減弱活性，甚至?xí)?dǎo)致受體脫敏或發(fā)生內(nèi)吞作用［22］.家蠶滯育激素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，BmDHR－1和BmDHR－5在蛹期血液中相對(duì)表達(dá)量很高，而其他幾個(gè)受體的表達(dá)量較低［7］，即 BmDHR－1和BmDHR－5是導(dǎo)致蠶卵滯育的主要受體.因此，本實(shí)驗(yàn)選擇BmDHR－1與BmDHR－5表達(dá)載體在BmN細(xì)胞中進(jìn)行同表達(dá).

不同摩爾比(1∶3，1∶1 和 3∶1)的 BmDHR －1/BmDHR－5表達(dá)載體，與p3Z－Bmtre－luc共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞后，熒光素酶活性均呈上調(diào)現(xiàn)象，且熒光素酶活性隨著BmDHR－5摩爾比的減小，上調(diào)倍數(shù)逐漸升高.說明BmDHR－1/BmDHR－5共表達(dá)上調(diào)Bmtre基因的表達(dá);BmDHR－5的過量表達(dá)對(duì)BmDHR－1的活性有一定的抑制作用.但是當(dāng)只有BmDHR－1單獨(dú)表達(dá)時(shí)，對(duì)luc基因上調(diào)倍數(shù)反而比BmDHR－1/BmDHR－5比例為3∶1時(shí)低，這是否由于BmDHR－1大量積累后形成同源二聚體，導(dǎo)致自身脫敏，從而失去受體作用，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究.

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