以稠油為唯一碳源的降解菌株的篩選與評價(jià)

李彩風(fēng)，徐闖，馮云，潘永強(qiáng)，李希明

（勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營 257000）

稠油是全球石油烴類資源中的重要組成部分，約占全球油氣資源總量的1／3.中國稠油、瀝青資源分布廣泛且儲(chǔ)量豐富［1－3］.稠油突出的特點(diǎn)是含瀝青質(zhì)、膠質(zhì)較高，從而導(dǎo)致原油黏度高且在儲(chǔ)層中的流動(dòng)性差，因此難于用常規(guī)方法進(jìn)行開采.鑒于稠油的特點(diǎn)，可以通過降低稠油黏度、減小油流阻力來進(jìn)行有效的開采，提高采收率.其中微生物降黏技術(shù)因具有適應(yīng)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、工藝簡單、無環(huán)境污染等優(yōu)勢成為具有良好發(fā)展前景的稠油降黏技術(shù)［4－6］.目前的研究主要集中在微生物產(chǎn)生生物表面活性物質(zhì)、酸、氣等代謝產(chǎn)物降低稠油黏度方面的工作［7］.以稠油為唯一碳源稠油降解菌種的篩選，相關(guān)研究報(bào)道較少［7］.其中，由于缺乏有效、直觀的檢測手段，降低了大量稠油降解菌種的篩選效率.針對這一情況，本文嘗試?yán)靡环N新的以稠油為唯一碳源的原油平板，快速選育出能有效降解稠油中膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的菌種，并評價(jià)了該菌種對稠油的降黏效果，為現(xiàn)場稠油微生物降黏技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種及原油來源

微生物的樣品來源為勝利油田油水井，稠油來自新疆塔河油田.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

生化培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，雙重蒸餾水器，電子分析天平，自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，表面張力儀，黏度計(jì)，PCR儀.

1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（g／L）：Na2HPO410，KH2PO410，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，NH4NO35，CaCl20.2，pH7.0～7.2，原油20.

原油平板（g／L）：NH4NO31.5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.2，NaCl 5，瓊脂粉20，調(diào)pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，取出后倒平板，待平板凝固，加入少量原油，用涂布棒涂布均勻即可.

斜面培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，瓊脂粉20，調(diào)pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，取出制成斜面.

營養(yǎng)平板（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，瓊脂粉20，調(diào)pH至7.0～7.2，121℃滅菌20min，然后冷卻至45～50℃后注入至已滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固即可.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 降解菌株的篩選

將勝利油田油水井中分離得到的5株菌接種于以稠油為唯一碳源的原油平板，40℃恒溫培養(yǎng)2d，觀察各菌株產(chǎn)生擴(kuò)油圈的情況.只有產(chǎn)生表面活性劑能夠乳化碳?xì)浠衔锏木瓴拍芪绽迷托纬蓴U(kuò)油圈，挑選產(chǎn)擴(kuò)油圈的菌落接種于斜面培養(yǎng)基上作進(jìn)一步研究.

2.2 菌株鑒定

將篩選的目標(biāo)菌株進(jìn)行基因組DNA提取，然后利用細(xì)菌16SrDNA測序方法進(jìn)行菌株分子生物學(xué)鑒定.16SrDNA的PCR擴(kuò)增引物為16SF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG（E.coli的16SrDNA對應(yīng)位置為8～27）和16SR：TACGGTTACCTTGTTACGACTT（E.coli的16SrDNA對應(yīng)位置為1492～1510），擴(kuò)增目的片段為1 500bp左右，引物由大連寶生物工程公司合成.100μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min.將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用BLAST分析軟件與Genebank中的基因序列進(jìn)行同源性比較.

2.3 原油性質(zhì)評價(jià)

2.3.1 原油黏度測定

在含有稠油的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，40℃恒溫振蕩培養(yǎng)，同時(shí)以不接菌的且含有稠油的液體培養(yǎng)基為空白對照.振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間，去除營養(yǎng)液，加入SLD7007破乳劑脫水，取脫水原油進(jìn)行原油黏度測試.利用毛細(xì)管黏度計(jì)在50℃下測定微生物作用前后原油的黏度，并求出其降黏率來顯示不同微生物菌液的降黏能力.

2.3.2 原油族組分測試

測試微生物作用前后原油中飽和烴、芳烴、非烴以及瀝青質(zhì)族組分的變化［8］.

2.4 不同時(shí)間瀝青質(zhì)降解測試

制備菌懸液接種于在以稠油為唯一碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，40℃下恒溫振蕩，將培養(yǎng)10，20，30，40，50d等不同時(shí)間的不同菌株作用后的稠油進(jìn)行瀝青質(zhì)含量的測試.

3 結(jié)果與討論

3.1 降解菌株篩選結(jié)果

利用稠油為唯一碳源的原油平板對油田污水中分離得到的能有效利用原油產(chǎn)生物表面活性劑菌株進(jìn)行稠油降解菌株篩選，圖1顯示菌株BY和TH能產(chǎn)生明顯的擴(kuò)油圈，說明這2株細(xì)菌能夠乳化碳?xì)浠衔锊⑽绽贸碛托纬蓴U(kuò)油圈.此外，菌株TH重復(fù)接種了2次，顯示2次產(chǎn)擴(kuò)油圈直徑大致相似，由此可見原油平板檢測重復(fù)性較好.

3.2 菌株鑒定

將2株細(xì)菌的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明：菌株TH鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株BY鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）.

3.3 原油乳化能力

將上述篩選出的菌株TH和BY接種于以塔河稠油為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，40℃，160r／min條件下振蕩培養(yǎng)5d.如圖2所示，2株菌均有較強(qiáng)的原油乳化能力，原油被乳化成小顆粒，培養(yǎng)基顏色均明顯變深，而空白對照中原油成塊狀漂浮在培養(yǎng)基上.顯微鏡下觀察菌株作用后原油乳化情況，從圖3可以看出菌株BY作用后的乳化油滴直徑在5μm左右，菌株TH作用后的乳化油滴直徑在10μm左右.結(jié)果表明，兩株細(xì)菌能以原油為碳源產(chǎn)生生物表面活性劑，促進(jìn)了原油在水相中的溶解和分散，從而可以改善稠油流動(dòng)性.

圖1 不同菌株原油平板產(chǎn)擴(kuò)油圈情況Fig.1 Oil spreading of different strains

圖2 菌株作用后原油外觀變化Fig.2 Appearance change of crude oil under strains

圖3 顯微鏡下菌株作用后原油乳化情況（400x）Fig.3 Microscopic observation of crude oil emulsification under strains

3.4 表面張力變化

研究表明，在烴類化合物的微生物降解過程中，為了使烴類通過外層親水細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞被降解酶降解，微生物常產(chǎn)生生物表面活性劑，由于其具有親水性和親脂性，從而可促進(jìn)烴類溶解來解決這一問題［9－10］.從圖4中可以看出，空白對照的溶液表面張力為63mN／m左右，而接種微生物的發(fā)酵液表面張力顯著降低，其中菌株BY的發(fā)酵液表面張力降低至35mN／m左右，菌株TH的發(fā)酵液表面張力降低至40mN／m左右，再次表明菌株TH和BY在以稠油為唯一碳源的情況下，均不同程度產(chǎn)生了生物表面活性物質(zhì)，從而導(dǎo)致發(fā)酵液的表面張力大大降低.

3.5 原油族組分變化

膠質(zhì)和瀝青質(zhì)是石油中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、分子質(zhì)量最大的一部分物質(zhì)，是稠油的主要成分，這正是導(dǎo)致稠油黏度較大的原因［11］.將菌株TH和BY分別接種于斜面，40℃恒溫培養(yǎng)2d，然后用無菌水將菌體洗下轉(zhuǎn)移至以稠油為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，40℃，160r／min條件下振蕩培養(yǎng)，將作用后的稠油進(jìn)行族組分分析，結(jié)果如表1所示.菌株BY和TH對原油中瀝青質(zhì)的降解效果較好，瀝青質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低率分別為40.7%和32.5%.

圖4 發(fā)酵液表面張力的變化Fig.4 Surface tension of the fermentation liquid

3.6 原油黏度變化

從表2可以看出稠油經(jīng)菌株TH和BY作用后，原油黏度均發(fā)生了顯著降低.其中，菌株TH作用后的原油黏度降低至1 635mPa·s，原油降黏率達(dá)53%；菌株BY作用后的原油黏度為1 250mPa·s，降黏率達(dá)64%.推測一是微生物對原油具有降解作用，破壞了原油中膠質(zhì)、瀝青質(zhì)等作為質(zhì)點(diǎn)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低了原油中重質(zhì)組分的相對含量，從而可以降低原油黏度，與3.5結(jié)果一致；二是微生物代謝產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)對原油產(chǎn)生了乳化作用，可以降低原油黏度，與3.2結(jié)果一致.

表1 不同菌株作用原油族組分分析Tab.1 Composition analyses of crude oil with different strains

表2 不同菌株對原油的降黏作用Tab.2 Viscosity reduction effect of crude oil with different strains

4 結(jié)論

1）通過以稠油為唯一碳源的原油平板實(shí)驗(yàn)篩選獲得2株降解菌BY和TH，分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus），其對稠油的乳化分散效果顯著，表明該菌能較好地利用稠油為碳源進(jìn)行生長繁殖代謝.

2）菌株BY和TH與稠油作用后均能顯著降低稠油中瀝青質(zhì)含量、原油黏度和表面張力，表明該菌能降解稠油中的重質(zhì)組分，并產(chǎn)生了生物表面活性劑等活性物質(zhì)，降低了原油黏度，從而可改善原油流動(dòng)性，在稠油開采技術(shù)中具有較好的應(yīng)用前景.

［1] 李亮.微生物在石油工業(yè)上的應(yīng)用［J］.國外油田工程，2000（8）：4－5.

［2] 于連東.世界稠油資源的分布及其開采技術(shù)的現(xiàn)狀與展望［J］.特種油氣藏，2001，8（2）：98－103.

［3] BANAT I M，MAKKAR R S，CAMEETRA S S.Potential commercial applications of microbial biosurfactants［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2000，53（5）：495－508.

［4] 向廷生，付華娥，張敏.不同微生物對青海原油的降解效果［J］.石油鉆采工藝，2007，29（2）：82－83.

［5] 齊義彬，王大威，吳萌萌，等.膠質(zhì)降解和生物乳化在稠油降黏中的作用［J］.石油學(xué)報(bào)，2012，33（4）：670－675.QI Yibin，WANG Dawei，WU Mengmeng，et al.Effect of resin degradation and biological emulsification on the viscosity break of heavy oils［J］.Acta Petrolei Sinica，2012，33（4）：670－675.

［6] 王春明，李大平，劉世貴.稠油開采微生物的生理生化特征及其對原油特性的影響［J］.石油學(xué)報(bào)，2007，28（5）：89－92.WANG Chunming，LI Daping，LIU Shigui.Effects of biophysiological and biochemical characteristics of a strain of microbacterium sp.on properties of thickened oil［J］.Acta Petrolei Sinica，2007，28（5）：89－92.

［7] 陳棟，李季，黃燕山，等.膠質(zhì)和瀝青質(zhì)對原油流動(dòng)性影響的紅外光譜研究［J］.應(yīng)用化工，2010，39（7）：1100－1104.CHEN Dong，LI Ji，HUANG Yanshan，et al.Influence of the colloid and asphaltene on fluidity of the crude oil by IR spectrum［J］.Applied Chemical Industry，2010，39（7）：1100－1104.

［8] SY／T5119—1995巖石可溶有機(jī)物和原油族組分柱層析分析方法［S］.

［9] 袁紅莉，楊金水，王占生，等.降解石油微生物菌種的篩選及降解特性［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2003，23（2）：157－161.YUAN Hongli，YANG Jinshui，WANG Zhansheng，et al.Microoganism screening for petroleum degration and its degrading characteristics［J］.China Environmental Science，2003，23（2）：157－161.

［10] HUA Zhaozhe，CHEN Yan，DU Guocheng，et al.Effects of biosurfactants produced by Candida antarctica on the biodegradation of petroleum compounds［J］.World Journal of Microbiology ＆Biotechnology，2004，20：25－29.

［11] 張廷山.微生物降解稠油及提高采收率實(shí)驗(yàn)研究［J］.石油學(xué)報(bào)，2001，22（1）：54－57.ZHANG Tingshan.Experiments on heaving oil degradation and enhancing oil recovery by microbial treatments［J］.Acta Petrolei Sinica，2001，22（1）：54－57.