可注射性熒光水凝膠用于抗癌蛋白質(zhì)藥物控制釋放的綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

鄧超

摘要：高分子水凝膠的制備、性能表征和應(yīng)用是大學(xué)材料化學(xué)和生物藥學(xué)專業(yè)學(xué)習(xí)的重要內(nèi)容。設(shè)計(jì)水凝膠制備的綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)大學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、科技創(chuàng)新能力和獨(dú)立解決問(wèn)題能力具有十分重要意義。本文主要設(shè)計(jì)一個(gè)新型的基于光控“點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)”的可注射性熒光水凝膠的教學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)。詳細(xì)介紹了可注射性熒光水凝膠的制備方法、流變分析和在抗癌蛋白質(zhì)藥物控制釋放中的應(yīng)用。本綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)新穎、方法可行性高、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯、應(yīng)用性強(qiáng)，必能很好地用于大學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

關(guān)鍵詞：水凝膠；流變分析；藥物控制釋放；抗癌蛋白質(zhì)藥物；教學(xué)實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：G424.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2014）08-0249-02

一、引言

高分子水凝膠（hydrogel）是一種能夠在水中溶脹，吸收并保持大量水分而又不溶解于水的三維聚合物溶脹體。高分子水凝膠網(wǎng)絡(luò)中可以充斥大量的水分，結(jié)構(gòu)上與機(jī)體組織相似，具有良好的生物相容性和尺寸可調(diào)節(jié)的多孔結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已被廣泛地用于隱形眼鏡、人工皮膚、人工角膜、人工軟骨組織等領(lǐng)域。水凝膠具有優(yōu)良的生物學(xué)性質(zhì)以及理化性質(zhì)，如生物粘附、生物相容以及生物降解性能，可以應(yīng)用在緩釋、脈沖釋放、觸發(fā)式釋放等新型給藥系統(tǒng)的研制中，也就說(shuō)可以將其應(yīng)用在可控藥物的釋放中。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)將制備一種新型的基于光控“點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)”的可注射性聚乙二醇水凝膠。通過(guò)調(diào)節(jié)光輻射的時(shí)間和位置，可以制備得到各種圖案化的熒光水凝膠。該水凝膠制備方法有機(jī)結(jié)合了光聚合和“點(diǎn)擊化學(xué)”的長(zhǎng)處，既有高效、快速和專一的特點(diǎn)，又有光聚合的時(shí)空可控性，同時(shí)無(wú)需任何毒性催化劑和引發(fā)劑，十分有利于蛋白質(zhì)藥物的包裹和控制釋放。

三、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)儀器。恒溫水浴鍋、流變儀、粗天平、電熱干燥箱、錐形瓶、燒杯、干燥管、減壓抽吸泵。

2.實(shí)驗(yàn)藥品。苯胺（Alfa Aesar），三乙胺（TEA，Aldrich），對(duì)甲?；郊姿幔?8.0%，TCI），四臂的聚乙二醇（PEO-4-OH，Mn=10 k，PegBio Co.，Ltd），甲基丙烯酸酐（MA，Merck），苯環(huán)酰肼（98.0%，TCI），N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，99%，Alfa Aesar），4-二甲氨基吡啶（DMAP，99% Alfa Aesar），二氯甲烷（CH2Cl2）用氫化鈣（CaCl2）干燥回流使用；細(xì)胞色素C購(gòu)買后直接使用；甲苯用鈉絲干燥回流后使用，所需試劑均為分析純。

四、測(cè)試與表征

1HNMR使用Unity Inova 400型共振波譜儀測(cè)定，選用氘代氯仿（CDCl3）、氘代二甲亞砜（DMSO-d6）為溶劑，將溶劑峰的化學(xué)位移作為參考標(biāo)準(zhǔn)。凝膠模量與凝膠時(shí)間用哈克RS6000（Thermo Scientific）流變儀測(cè)試，間距為0.5mm，溫度為37℃，頻率為1Hz，剪切應(yīng)變?yōu)?%。流變儀上配置UV引發(fā)裝置，光強(qiáng)有10.0 mW/cm2、20.6 mW/cm和30.7 mW/cm2三個(gè)等級(jí)，激發(fā)的波長(zhǎng)在365±5nm左右[1]。紫外UV暗箱，激發(fā)波長(zhǎng)在365±5nm左右，光強(qiáng)為60.0 mW/cm2。

五、實(shí)驗(yàn)步驟以及注意事項(xiàng)

1.四唑（Tet）小分子的合成。在通入氮?dú)獾谋Ｗo(hù)條件下，在100mL兩頸瓶中進(jìn)行進(jìn)行操作，再50mL乙醇中取0.75g（5mmol）對(duì)甲?；郊姿岢浞秩芙?，然后加入0.86g （5mmol）苯磺酰肼，溶解充分后，再攪拌0.5h，再用二次水沉淀法，干燥，得到淡黃色固體苯腙1.2975g，產(chǎn)率達(dá)到85.4 %。將0.23mL苯胺溶于水、乙醇、濃鹽酸三者混合溶液中，其中有2mL水、2mL乙醇、0.65mL濃鹽酸，在冰水水浴條件下，在1ml二次水中溶解0.175gNaNO2固體，完全溶解后逐滴將其加入到上述混合溶液中，攪拌15min，得到淡黃色的重氮苯溶液。在15ml吡啶溶解0.6g苯腙，充分溶解后，逐滴將其加入到上述淡黃色的重氮苯溶液中，反應(yīng)溫度控制在0℃，反應(yīng)6h，得到紅棕色的溶液，用乙酸乙酯對(duì)該溶液進(jìn)行4次萃取，每次取10ml，分離得到有機(jī)相，之后再加入120ml，3MHCl進(jìn)行萃取分層，取上層的有機(jī)層，通過(guò)過(guò)濾、真空干燥得到0.206 g粉紅色的固體，產(chǎn)率達(dá)到39.4%。

2.四臂的聚乙二醇的四唑衍生物（PEG-4-Tet）的合成。在通氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，將0.216g四唑充分溶解于15ml二氯甲烷中，然后加入120mgDCC，充分?jǐn)嚢?5min。將10K，0.5 gPEG溶解于2mL二氯甲烷中，然后加到上述四唑溶液中，混合攪拌10min后再加入10mgDMAP，充分反應(yīng)24h，之后過(guò)濾，用冰乙醚沉淀，干燥后得到產(chǎn)物0.421g，產(chǎn)率為90.4%。

3.四臂的聚乙二醇甲基丙烯酸酯衍生物的合成。在通入氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，向25mL密封反應(yīng)器中加入四臂聚乙二醇0.5g，120μL三乙胺Et3N，240μL甲基丙烯酸酐，4.9mgDMAP，10mL甲苯，將反應(yīng)器密封好，置于70℃油浴中反應(yīng)24h，之后用冰乙醚沉淀過(guò)濾，在常溫下真空干燥得產(chǎn)物0.45g，產(chǎn)率為60.5%。

4.水凝膠的制備和流變分析。水凝膠按如下方法制備：分別將一定的PEG-4-Tet（DS81.6%）和PEG-4-MA溶于PB（200μL，pH7.4，10mM）中制備得到濃度分別為20wt%或30wt%的溶液，在室溫下將兩種溶液充分、均勻混合，置于波長(zhǎng)365nm的紫外燈下，照射10min形成凝膠。通過(guò)使用遮光模板先蓋住聚合物溶液，然后再用紫外光輻射可以制備得到設(shè)計(jì)圖案的水凝膠，這些圖案可以用熒光顯微鏡觀察并拍照2]。采用RS6000流變儀（Thermo-Fisher，Germany），在37℃下Φ20mm的測(cè)試平臺(tái)上進(jìn)行流變分析操作。將PEG-Tet和PEG-MA的PB混合溶液加到測(cè)試平臺(tái)上，然后在在液體表面滴加少量的油防止測(cè)試過(guò)程中水分的揮發(fā)。測(cè)試得到儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）隨時(shí)間變化的關(guān)系圖。水凝膠的凝膠時(shí)間定義為從測(cè)試開始到G′= G″時(shí)所耗費(fèi)的時(shí)間。

六、結(jié)果與討論

本綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)新穎、方法可行性高、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯以及應(yīng)用價(jià)值較高。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)在反應(yīng)條件以及測(cè)試方法等方面進(jìn)行了較大的改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，可以保證試驗(yàn)教學(xué)的成功率；另外在保護(hù)環(huán)境、節(jié)約藥品以及控制教學(xué)時(shí)間等方面也取得較為理想的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]田帥.聚乙二醇、聚乙烯醇改性雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備與表征[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[2]陳歡歡，昝佳，林瑩，蔣國(guó)強(qiáng)，丁富新.殼聚糖/聚乙烯醇溫敏水凝膠的制備及性質(zhì)研究[J].清華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，（06）：93-96.

[3]張啟鳳.羥丙基殼聚糖及其水凝膠的理化性能和藥物緩釋應(yīng)用研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2003.endprint