白藜蘆醇對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞凋亡及組織蛋白酶B表達(dá)的影響*

馬曜輝，單中杰

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)鄭州人民醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450012

組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)屬于木瓜蛋白家族，是溶酶體內(nèi)最重要的組織蛋白酶，能夠降解各種組織蛋白[1]。CB除了參與重要的生理功能外還參與了多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、凋亡過(guò)程[2-4]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，在葡萄、花生、虎杖等藥用植物中廣泛存在。RES除了具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等作用外[5]，近年來(lái)其抗腫瘤作用備受關(guān)注，可以促進(jìn)多種腫瘤的凋亡。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，90%以上為移行細(xì)胞癌。作者應(yīng)用RES作用于人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡和CB表達(dá)的變化，探討RES誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的機(jī)制，以期為膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;RES(純度為99%)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RES用DMSO配置成100 mmol/L的原液，－20℃保存?zhèn)溆谩PMI 1640培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(日本 Toyobo公司);CB和β-actin一抗(美國(guó)Abgent公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司);RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司);PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司);流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)。

1.2 T24細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U/L青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液1次。2.5 g/L的胰蛋白酶消化、傳代細(xì)胞。

1.3 T24細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞，將細(xì)胞消化并吹散制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，用含終濃度為25 μmol/L RES的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，以只含有培養(yǎng)基的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。嚴(yán)格按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞分別用2.5 g/L的胰蛋白酶消化、離心，棄上清，重懸，加入 Annexin V-FITC避光孵育15 min，加入PI避光孵育5 min，30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 CB mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-PCR法。分組同1.3，細(xì)胞培養(yǎng) 24、48、72 h 后用 Trizol法提取總RNA溶解于無(wú)RNA酶的水中。用酶標(biāo)儀測(cè)定、計(jì)算各組提取總RNA的濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。采用由上海捷瑞生物工程有限公司合成的CB、β-actin引物，序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃45 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。配置20 g/L的瓊脂糖凝膠，取RT-PCR產(chǎn)物5 μL在80 V的恒壓下電泳30 min。用Alpha多功能成像系統(tǒng)采集圖像并分析圖像，以CB與β-actin電泳條帶積分光密度的比值表示CB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CB蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。分組同1.3。用蛋白提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組24、48、72 h的T24細(xì)胞總蛋白。提取的蛋白采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。測(cè)定后用裂解液將各樣本總蛋白的濃度進(jìn)行配平，使各樣本總蛋白濃度相同。沸水3 min，蛋白變性;100 V 60 min，電泳;轉(zhuǎn)膜;封閉;洗膜;一抗孵育(CB按照1∶500稀釋?zhuān)瑑?nèi)參β-actin按照1∶1000稀釋)，4℃過(guò)夜;二抗孵育1 h;洗膜;高靈敏化學(xué)發(fā)光顯色，用Alpha多功能成像系統(tǒng)采集圖像并分析圖像，以CB與βactin光密度值的比值表示CB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，各組細(xì)胞凋亡率和CB表達(dá)的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組T24細(xì)胞的凋亡情況 見(jiàn)表1。

2.2 各組T24細(xì)胞CB mRNA的表達(dá) 見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞CB mRNA表達(dá)情況

2.3 各組T24細(xì)胞CB蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖2、表1。

圖2 各組細(xì)胞CB蛋白表達(dá)情況

表1 各組細(xì)胞凋亡、CB mRNA和蛋白表達(dá)情況(n=3)

3 討論

細(xì)胞凋亡是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，就目前的研究現(xiàn)狀，細(xì)胞凋亡途徑大致可分為外源性途徑(死亡受體凋亡途徑)和內(nèi)源性途徑;內(nèi)源性途徑又可以分為經(jīng)典的線(xiàn)粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑[6]以及2006 年 Terman 等[7]提出的溶酶體線(xiàn)粒體軸凋亡途徑。溶酶體線(xiàn)粒體軸凋亡途徑指各種原因?qū)е氯苊阁w膜不穩(wěn)定，進(jìn)而使溶酶體內(nèi)的水解酶釋放，特別是半胱氨酸蛋白酶的釋放活化。溶酶體中最重要的是組織蛋白酶家族，CB又是其中最重要的一個(gè)。這些蛋白酶可以水解促凋亡蛋白，從而直接或間接地導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜的通透性增加，使線(xiàn)粒體釋放大量的細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡激酶活因子-1結(jié)合，啟動(dòng)凋亡小體的形成[8]。凋亡小體活化Caspase家族中的Caspase-9結(jié)合，進(jìn)而活化Caspase-3后裂解細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。在整個(gè)溶酶體線(xiàn)粒體軸凋亡途徑中溶酶體內(nèi)的水解酶起著至關(guān)重要的作用。也有研究[10]表明，CB除了參與溶酶體線(xiàn)粒體軸凋亡途徑外，它還可以直接激活Caspase-9，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。

RES是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，最早從毛葉藜蘆中獲得[11]，隨后在多種中藥植物的根部均有發(fā)現(xiàn)，它主要是植物為對(duì)抗外界不良刺激分泌的保護(hù)劑。其具有抗氧化、抗炎、抗輻射、保護(hù)心血管等作用[5]，近年來(lái)其抗腫瘤作用備受關(guān)注，目前在肺癌[12]、肝癌[13]、胃癌[14]、前列腺癌[15]、腎細(xì)胞癌[16]等組織中均發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但其作用機(jī)制目前被大家認(rèn)可的一個(gè)是通過(guò)外源性凋亡途徑，外界刺激作用于特異性死亡受體，激活Caspase家族中的Caspase-8，繼而活化Caspase-3后裂解多種細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;一個(gè)是經(jīng)典的線(xiàn)粒體途徑，各種原因?qū)е碌木€(xiàn)粒體通透性增加后，釋放細(xì)胞色素C，啟動(dòng)形成凋亡小體[17-18]。

該研究觀察了RES對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞凋亡的影響及CB mRNA和蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)RES誘導(dǎo)的T24細(xì)胞的凋亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高;隨著細(xì)胞凋亡率的增加，CB mRNA和蛋白的表達(dá)均升高;提示CB可能參與了RES誘導(dǎo)的T24細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能為RES作用于細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞溶酶體膜通透性改變，從而導(dǎo)致CB大量釋放于細(xì)胞質(zhì)中。以上結(jié)果提示可以通過(guò)應(yīng)用CB激活劑來(lái)進(jìn)一步加速膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。由于其整體的作用機(jī)制還不十分清楚，還需要進(jìn)一步的研究，以期為臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。

[1]Buck MR，Karustis DG，Day NA，et al.Degradation of extracellular matrix proteins by human cathepsin B from normal and tumour tissues[J].Biochem J，1992，282(Pt 1):273

[2]Chwieralski CE，Buhling F.Cathepsin regulated apoptosis[J].Apoptosis，2006，11(2):143

[3]Mohamed MM，Sloane BF.Cysteine cathepsins:multifunctional enzymes in cancer[J].Nat Rev Cancer，2006，6(10):764

[4]婁欣，張紅，曹學(xué)全，等.組織蛋白酶B特異性siRNA對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞組織蛋白酶B基因表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，42(1):14

[5]李瑩，張楠，劉芳麗，等.白藜蘆醇對(duì)鉛暴露小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，48(3):327

[6]Bredesen DE，Rao RV，Mehlen P.Cell death in the nervous system[J].Nature，2006，443(7113):796

[7]Terman AG，Gustafsson B，Brunk UT.The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death[J].Chem Biol Interact，2006，163(1/2):29

[8]Pupyshev AB.Lysosomal membrane permeabilization as apoptogenic factor[J].Tsitologiia，2011，53(4):313

[9]Wu CC，Bratton SB.Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive Oxygen species[J].Antioxid Redox Signal，2013，19(6):546

[10]Guicciardi ME，Leist M，Gores GJ.Lysosomes in cell death[J].Oncogene，2004，23(16):2881

[11]Ferrero ME，Bertelli AA，Pellegatta F，et al.Phytoalexin resveratrol(3-4-5-trihydroxystilbene)modulates granulocyte and monocyte endothelial adhesion[J].Transplant Proc，1998，30(8):4191

[12]Yin HT，Tian QZ，Guan L，et al.In vitro and in vivo evalua-tion of the antitumor efficiency of resveratrol against lung cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(3):1703

[13]Choi HY，Chong SA，Nam MJ.Resveratrol induces apoptosis in human SK-HEP-1 hepatic cancer cells[J].Cancer Genomics Proteomics，2009，6(5):263

[14]王貴琴，鄭湘予，吳成富，等.白藜蘆醇對(duì)裸鼠胃癌移植瘤組織中人程序化死亡分子5 mRNA表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45(4):569

[15]Chen Q，Ganapathy S，Singh KP，et al.Resveratrol induces growth arrest and apoptosis through activation of FOXO transcription factors in prostate cancer cells[J].PLoS One，2010，5(12):e15288

[16]單中杰，郭亮，侯箐嵐，等.白藜蘆醇對(duì)人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞周期、凋亡及PDCD5 mRNA表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，47(2):182

[17]Yaseen A，Chen S，Hock S，et al.Resveratrol sensitizes acute myelogenous leukemia cells to histone deacetylase inhibitors through reactive Oxygen species-mediated activation of the extrinsic apoptotic pathway[J].Mol Pharmacol，2012，82(6):1030

[18]Zhang W，Wang X，Chen T.Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells[J].Mol Cell Biochem，2011，354(1/2):29