聚乙烯亞胺-黃芪多糖共聚物的制備及其基因傳遞性能觀察*

張丹丹，任雪玲，何阿妹，張 紅，周宇雪，張振中#

1)河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

人類(lèi)疾病都直接或間接與基因異常有關(guān)，因此基因治療已成為治療包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的有效方法之一[1]?；蛑委煶晒εc否的關(guān)鍵之一在于高效、低毒的基因傳遞載體[2]。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是最具代表性的高效基因傳遞載體之一[3]，但其細(xì)胞毒性也不容忽視[4]。多糖及其衍生物不僅具有生物相容性好、可生物降解等特點(diǎn)，同時(shí)也能夠有效壓縮DNA并將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，已逐漸引起人們的關(guān)注[5]。但是，多糖通常體內(nèi)、體外轉(zhuǎn)染效率較低。有研究[6]顯示，將PEI接枝在多糖上能夠顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率。Wong等[7]在殼聚糖的結(jié)構(gòu)中接枝PEI，所得產(chǎn)物不僅極大提高了基因轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)有效降低了細(xì)胞毒性。因此，PEI-多糖共聚物已成為目前非病毒基因傳遞載體的研究熱點(diǎn)之一。黃芪是一種重要的中藥材，具有抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功效[8]。黃芪多糖是黃芪的主要生物活性成分[9]，不僅具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫力的功效，同時(shí)作為一類(lèi)多羥基醛酮類(lèi)化合物，可以提供多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行改性。該研究中作者對(duì)黃芪多糖進(jìn)行PEI改性，制備PEI-黃芪多糖共聚物(PEI-RAP)，并進(jìn)一步研究其與核酸的相互作用，探索其負(fù)載核酸作為非病毒基因傳遞載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 黃芪多糖(相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×104～2.0×104)購(gòu)自西安斯諾特生物技術(shù)有限公司;PEI(相對(duì)分子質(zhì)量為600)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司;人乳癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞Hela和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng);綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP由作者所在的學(xué)院構(gòu)建并保存。十六烷基三甲基溴化銨、羰基二咪唑(CDI)、高碘酸鉀(KIO4)、硼氫化鈉、氮丙啶、乙二胺均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 PEI-RAP的制備及表征鑒定

1.2.1 氮丙啶法[7]將0.1045 g黃芪多糖Ⅰ加入裝有10 mL去離子水的50 mL圓底燒瓶中，攪拌下加入0.1526 g KIO4，室溫避光反應(yīng)48 h后將反應(yīng)溶液裝入透析袋中透析48 h。將透析液滴加至含有200 μL乙二胺的5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 9.8)中，1 h內(nèi)滴加完畢，室溫?cái)嚢?6 h。稱(chēng)取0.1011 g硼氫化鈉，加入到上述溶液中，攪拌 48 h。再加入0.0504 g硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌24 h。將上述反應(yīng)液加入到2 mL 1 mol/L HCl溶液(含400 μL氮丙啶)中，攪拌5 d。最后將反應(yīng)液透析3 d，冷凍干燥即得產(chǎn)物Ⅱ。

1.2.2 KIO4-PEI法[10]將 0.1023 g 黃芪多糖加入裝有10 mL去離子水的50 mL圓底燒瓶中，攪拌下加入0.1513 g KIO4，避光攪拌48 h后將反應(yīng)液裝入透析袋中透析48 h。將透析液滴加至含有0.2684 g PEI的5 mL磷酸鹽緩沖液中，1 h內(nèi)滴加完畢，然后室溫?cái)嚢?6 h。將0.1018 g硼氫化鈉加入到上述溶液中，攪拌48 h。再次將0.0502 g硼氫化鈉加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌24 h。最后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥即得產(chǎn)物Ⅲ。

1.2.3 CDI-PEI法[11]氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向含有0.0780 g黃芪多糖的8 mL DMSO中依次加入100 μL三乙胺、0.2120 g CDI的 DMSO 溶液4 mL，避光劇烈反應(yīng)4 h。然后向反應(yīng)液中滴加含0.7568 g PEI的DMSO溶液6 mL，最后加入50 μL三乙胺，避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)液經(jīng)透析、冷凍干燥，即得產(chǎn)物Ⅳ。

1.2.4 結(jié)構(gòu)表征鑒定 將少量黃芪多糖以及3種反應(yīng)產(chǎn)物分別與溴化鉀壓成薄片，在NICOLET iS10型紅外光譜儀上測(cè)定傅里葉變換紅外光譜。

1.3 PEI-RAP與pEGFP的作用

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 將PEI-RAP與pEGFP 分別按質(zhì)量比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 混合均勻，室溫靜置30 min。采用北京君意JY600電泳儀以及美國(guó)SIM公司Bio-Best 200E凝膠成像分析系統(tǒng)考察PEI-RAP對(duì)pEGFP的負(fù)載作用。

1.3.2 粒徑與 Zeta電位分析 將 PEI-RAP與pEGFP按質(zhì)量比12∶1混合均勻，采用英國(guó)馬爾文公司 Nano-ZS90納米粒度分析儀測(cè)定 PEI-RGP/pEGFP復(fù)合物的粒徑與Zeta電位。

1.4 PEI-RAP的細(xì)胞毒性 將 MCF-7、Hela和SMMC-7721細(xì)胞分別接種于96孔板，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃條件下，于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70% ～80%，加入150 mg/L PEI-RAP，24 h后棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入0.5 g/L MTT 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液并加入100 μL DMSO，測(cè)定570 nm的OD值。細(xì)胞存活率=[(OD實(shí)驗(yàn)組－OD空白組)/(OD對(duì)照組－OD空白組)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 pEGFP的體外轉(zhuǎn)染 MCF-7、Hela和 SMMC-7721細(xì)胞分別在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前16 h按照每孔1.2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。將 PEI-RAP與 pEGFP按質(zhì)量比12∶1(18 mg/L PEI-RAP，1.5 mg/L pEGFP)混勻，室溫培養(yǎng)30 min后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PEI-RAP的合成與表征 黃芪多糖以及3種反應(yīng)的產(chǎn)物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，4種樣品中均存在3600～3200 cm－1處的多糖O-H伸縮振動(dòng)峰及3000～2800 cm－1處的C-H伸縮振動(dòng)峰。但是，只有產(chǎn)物Ⅱ的紅外譜圖中在1734 cm－1出現(xiàn)了新的特征峰，1734 cm－1是氨基的變形振動(dòng)峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)氮丙啶法成功制備得到PEI-RAP，而直接將PEI連接在黃芪多糖上的KIO4-PEI和CDI-PEI法并未得到預(yù)期產(chǎn)物。

圖1 樣品的紅外吸收光譜

2.2 PEI-RAP與 pEGFP的相互作用 PEI-RAP共聚物與pEGFP以不同質(zhì)量比結(jié)合后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著PEI-RAP共聚物含量的不斷增加，pEGFP的量及遷移速率受到影響，當(dāng)兩者的質(zhì)量比達(dá)到10∶1以上時(shí)，pEGFP條帶完全消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEI-RAP可以負(fù)載pEGFP，當(dāng)兩者質(zhì)量比達(dá)到10∶1以上，pEGFP可與PEI-RAP完全結(jié)合。

圖2 PEI-RAP負(fù)載pEGFP的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

當(dāng)PEI-RAP與pEGFP的質(zhì)量比為12∶1時(shí)，PEI-RAP/pEGFP復(fù)合物的粒徑為156.61 nm，電位達(dá) +26.89 mV。

2.3 PEI-RAP的細(xì)胞毒性 MTT結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入150 mg/L PEI-RAP復(fù)合物，MCF-7、Hela和 SMMC-7721細(xì)胞的存活率分別為(102.21 ±8.92)%、(96.07 ±7.10)%和(109.52 ±2.05)%。

2.4 pEGFP的體外轉(zhuǎn)染 見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)染pEGFP的MCF-7、Hela和SMMC-7721細(xì)胞中均能觀察到綠色熒光。PEI-RAP復(fù)合物將 pEGFP轉(zhuǎn)染至MCF-7、Hela以及SMMC-7721細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別是(82.64 ±1.27)%、(85.37 ± 6.10)% 和(93.06 ±0.72)%。

圖3 PEI-RAP負(fù)載pEGFP轉(zhuǎn)染MCF-7(A)、Hela(B)和SMMC-77213(C)細(xì)胞株(×200)

3 討論

在基因治療領(lǐng)域，尋找理想的基因傳遞載體仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。多糖是自然界中廣泛存在的一種生物大分子，具有很好的生物相容性[12-13]。但是，在多糖結(jié)構(gòu)中缺乏與核酸相互作用的基團(tuán)，因此轉(zhuǎn)染效率一直限制其進(jìn)一步發(fā)展。PEI是目前研究最為廣泛的陽(yáng)離子化非病毒基因傳遞載體。在PEI的表面含有大量氨基，從而攜帶大量正電荷。這些正電荷的存在不僅使得PEI可以與負(fù)電荷的DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，而且能夠通過(guò)細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)釋放DNA，從而達(dá)到高效傳遞治療基因的目的。但是，也正是由于這些高密度正電荷的存在，使PEI表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性[14]。有研究[15-16]顯示，將多糖與PEI連接在一起，可以得到一種新型的多糖-PEI復(fù)合載體，它不僅具有高基因轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)不表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。新型的多糖-PEI復(fù)合載體已成為非病毒基因傳遞載體的研究熱點(diǎn)之一。

該研究所選用的黃芪多糖不含有陽(yáng)離子基團(tuán)，因此其本身并不適合作為基因傳遞載體。作者采用化學(xué)方法以PEI對(duì)黃芪多糖進(jìn)行陽(yáng)離子改性，希望能夠得到一種新的非病毒基因傳遞載體。PEI-多糖的制備通常有兩種策略，一種是以氮丙啶為單體，直接在多糖分子上聚合得到;另外一種是采用一定反應(yīng)將多糖分子直接與PEI連接在一起。該研究中，作者嘗試用氮丙啶法、KIO4-PEI法和CDI-PEI法制備PEI-RAP。紅外吸收光譜顯示通過(guò)氮丙啶法構(gòu)建得到了PEI-RAP復(fù)合物，而另外兩種方法并未得到目的產(chǎn)物，這可能與黃芪多糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)。文獻(xiàn)[17]顯示，黃芪多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖等單糖組成，在其分子結(jié)構(gòu)中含有1條主鏈和多種形式的支鏈，其復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)可能限制相對(duì)分子質(zhì)量較大的PEI的直接連接，造成KIO4-PEI和CDI-PEI法均未得到預(yù)期產(chǎn)物。

PEI-RAP與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)顯示，PEI-RAP可以有效負(fù)載DNA。另外，PEI-RAP幾乎不顯示細(xì)胞毒性，并且能夠?qū)EGFP轉(zhuǎn)染至3種細(xì)胞，成功表達(dá)出綠色熒光，具有較高的轉(zhuǎn)染效率。因此，以黃芪多糖為骨架的新型陽(yáng)離子聚合物PEI-RAP是一種有效的、有潛在應(yīng)用前景的非病毒基因傳遞載體。

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