輻照骨髓淋巴細胞對成骨細胞的影響

鄒 瓊 丁巧靈 徐小雅 周 軼 金慰芳 高建軍

（復旦大學放射醫(yī)學研究所 上海 200032）

Arron等[1]于 2000年首次提出骨免疫學的概念，描述了骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，免疫失調(diào)可導致骨代謝異常。近來許多研究顯示，骨免疫參與了類風濕關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、Paget骨病、骨溶解等諸多骨科疾病的發(fā)生與發(fā)展，揭示了免疫系統(tǒng)對骨代謝的重要調(diào)節(jié)作用[2]。

成骨細胞起源于未分化的間充質(zhì)中的多潛能干細胞，在生長因子、激素和細胞因子的共同作用下，通過激活轉錄因子RUNX2、ATF4和Osterix等調(diào)控間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)是成骨細胞分化和功能的重要標志之一，在基質(zhì)礦化中起著關鍵性的作用。ALP活性高低一定程度上可以反映出細胞的成骨分化活性。骨鈣素(Osteocalcin, OCN)是分化晚期成骨細胞分泌的骨蛋白，其水平與成骨細胞活性呈正相關。骨保護素(Osteoprotegerin, OPG)和(Ligand of receptor activator of NF-KB, RANKL)是通過成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞表達的，可以相互競爭性結合破骨細胞膜上的RANK。OPG和RANKL比值的改變可以影響破骨細胞的分化，活化和凋亡。本研究通過細胞增殖分化以及ALP、0CN、0PG和RANKL基因表達，研究輻照淋巴細胞對成骨細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱，環(huán)流熱空氣消毒箱購自德國Heraeus公司；倒置相差顯微鏡購自日本 Nikon公司；Mx3000P實時定量 PCR系統(tǒng)購自美國Stratagene公司；酶標儀 Elx800購自美國 Bio-Tek公司；培養(yǎng)瓶/板/皿/Transwell購自英國Corning公司；RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國GIBCO公司；PNPP購自美國Amresco公司；二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽購自上海思吉生物制品有限公司；TRIZOL 試劑，M-MLV RT Kits試劑盒，Platinum?SYBR? Green qPCR SuperMix- UDG試劑盒購自美國Invitrogen 公司；HISTOPAQUE?1083購自美國SIGMA公司。

1.2 淋巴細胞和成骨細胞分離培養(yǎng)

(100±10)g SD大鼠，氯胺酮(0.2mL/100g)麻醉，頸動脈放血處死，取雙側股骨和脛骨，用注射器將骨髓沖出，200目濾器過濾至15mL，于離心管中1500 r·min-1離心5 min收集細胞，取另一15mL離心管加入3mL HISTOPAQUE?1083，3mL PBS重懸細胞液沿管壁緩慢加入離心管，最后沿管壁加入1mL RPMI1640 培養(yǎng)液，2000 r·min-1離心 30 min，吸取兩分界層中的單個核細胞，6mL RPMI1640培養(yǎng)液1000 r·min-1離心5 min兩次，8mL 10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶，置5% CO2培養(yǎng)箱、37 ℃下培養(yǎng)。24 h后棄除貼壁單核細胞，取全部培養(yǎng)液離心后重懸細胞置 5% CO2培養(yǎng)箱、37 ℃下培養(yǎng)。

新生(<24 h)SD大鼠，用 70%的酒精浸泡消毒10 min，機械取下頭蓋骨，置PBS內(nèi)清除結締組織后剪成1mm2大小，0.25% Trypsin 37 ℃下預消化20 min，棄消化液，再將骨片置0.1% CollagenaseⅡ振蕩消化1 h 2次，合并兩次消化液，1000 r·min-1離心10 min棄上清，細胞沉淀用10% FBS MEM重懸，計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶，置5% CO2培養(yǎng)箱、37 ℃下培養(yǎng)。

1.3 淋巴細胞和成骨細胞輻照共培養(yǎng)

取第二繼代成骨細胞分別以 1×103/孔密度接種于96孔共培養(yǎng)板，1×105/皿接種于6孔共培養(yǎng)板；淋巴細胞以 1×104/孔接種于共培養(yǎng)條，5×105/皿接種于共培養(yǎng)皿。淋巴細胞培養(yǎng)3 d，成骨細胞匯合后，以137Cs γ射線放射源分別進行6 Gy照射，照射劑量率為0.783 Gy·min-1，照后兩種細胞馬上共培養(yǎng)，分組為0 Gy成骨細胞+0 Gy淋巴細胞(0OB0L)，0 Gy成骨細胞+6 Gy淋巴細胞(0OB6L)，6 Gy成骨細胞+6 Gy淋巴細胞(6OB6L)，共培養(yǎng)6 h后取淋巴細胞與正常二代成骨細胞共培養(yǎng)。

1.4 輻照淋巴細胞對成骨細胞增殖和分化的影響

共培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液用PBS清洗，每孔加入無血清MEM培養(yǎng)液100 L及MTT 10 L，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，加入20%的SDS100 L，37 ℃放置2 h，經(jīng)酶標儀570nm波長測吸光度，結果以A570表示。另一組培養(yǎng)3 d后用PBS清洗，每孔加入 50 mmol·L-1DEA100 L，3 mmol·L-1PNPP 50 L 37 ℃孵育 30 min，加入 0.2 mmol·L-1氫氧化納 50 L終止反應，在酶標儀405nm波長測吸光度，結果以A405表示。

1.5 成骨細胞相關基因的表達

共培養(yǎng) 2 h后棄培養(yǎng)液，每皿細胞均加入TRIZOL 0.5mL，氯仿異丙醇法提取RNA，DEPC水溶解，紫外分光光度計測定260nm和280nm處的吸收值，計算 RNA溶液濃度和純度。按試劑盒方法進行逆轉錄和Realtime PCR。引物序列，ALP:forward 5’ TCCCAAAGGCTTCTTCTTGC3’, reverse 5’ATGGCCTCATCCATCTCCAC3’(108 bp,NM_013059.1); OCN: forward 5’CTGAGTCTGACAAAGCCTTC3’, revrers 5’CCATAGATGCGCTTGTAGGC3’(205 bp,NM013414.1), OPG: forward 5’ATACAGACAGCTGGCACACG3’, reverse 5’TGCTTTCGATGACGTCTCAC3’(266 bp, U94330);RANKL: forward 5’ ACCAGCATCAAAATCCCAAG 3’, reverse 5’ GGACGCTAATTTCCTCACCA 3’(132 bp, AF187319); GAPDH: forward 5’AAACCCATCACCATCTTCCA 3’, reverse 5’GTGGTTCACACCCATCACAA 3’(198 bp,DQ403053)。產(chǎn)物經(jīng)融解曲線單峰驗證，于T階段采集信號獲得 Ct值，計算各測試基因與內(nèi)參基因GAPDH比值作相對分析。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 輻照骨髓淋巴細胞抑制成骨細胞分化

輻照淋巴細胞與相關成骨細胞共培養(yǎng)6 h后，對正常成骨細胞的分化明顯抑制，ALP活性檢測結果顯示：0OB6L組較 0OB0L組下降15.98%(p<0.01)；6OB6L組較 0OB0L組下降28.53%(p<0.001)；6OB6L組較 0OB6L組下降14.93%(p<0.05) (見圖1)。對正常成骨細胞的增殖無明顯影響，統(tǒng)計學無差異（見圖2）。

2.2 輻照骨髓淋巴細胞抑制成骨細胞 ALP和OCN的表達

輻照淋巴細胞與相關成骨細胞共培養(yǎng)6 h后，對正常成骨細胞ALP和OCN的mRNA表達明顯抑制，相應溶解曲線只有一個峰（見圖3-5）。Real time PCR 的結果顯示：0OB6L組ALP的mRNA水平較0OB0L組下降20.96%(p<0.01)，6OB6L組較0OB0L組下降達39.33%(p<0.001)，6OB6L組ALP水平又較0OB6L組下降23.25%(p<0.05)(見圖6)；0OB6L組OCN的mRNA水平較0OB0L組下降19.02%(p<0.05)，6OB6L組較 0OB0L組下降達40.49%(p<0.001)，6OB6L組OCN水平又較0OB6L組下降26.52%(p<0.05)（見圖7）。

圖1 成骨細胞分化效應Fig.1 Effects on the differentiation of osteoblast

圖2 成骨細胞增殖效應Fig.2 Effects on the proliferation of osteoblast

圖3 GAPDH溶解曲線Fig.3 Melting curves of GAPDH

圖4 ALP溶解曲線Fig.4 Melting curves of ALP

圖5 OCN溶解曲線Fig.5 Melting curves of OCN

圖6 ALP的mRNA表達Fig.6 The relative mRNA expression of ALP

圖7 OCN的mRNA的表達Fig.7 The relative mRNA expression of OCN

2.3 輻照骨髓淋巴細胞促進成骨細胞RANKL表達，RANKL/OPG比值上升

輻照淋巴細胞與相關成骨細胞共培養(yǎng)6 h后，對正常成骨細胞RANKL的mRNA表達明顯促進，OPG 的表達無明顯影響（見圖 8），RANKL/OPG比值明顯升高，相應溶解曲線只有一個峰（見圖 9和圖10）。

圖8 OPG的mRNA的表達Fig.8 The relative mRNA expression of OPG

圖9 OPG溶解曲線Fig.9 Melting curves of OPG

圖10 RANKL溶解曲線Fig.10 Melting curves of RANKL

Real time PCR 的結果顯示：0OB6L組RANKL的mRNA水平較0OB0L組上升42.45%(p<0.05)，6OB6L組較 0OB0L組上升 121.04%(p<0.001)，6OB6L組 RANKL水平又較 0OB6L組上升55.17%(p<0.001) (見圖 11)；0OB6L 組 RANKL/OPG的比值較0OB0L組上升40.04%(p<0.001)，6OB6L組較 0OB0L組上升 138.07%(p<0.001)，6OB6L組又較0OB6L組上升70.00%(p<0.001)（見圖12）。

圖11 RANKL的mRNA的表達Fig.11 The relative mRNA expression of RANKL

圖12 RANKL/OPG的比值結果以±s, n=4;***p<0.001, 與0OB0L組比較,###, p<0.001, 與0OB6L組比較Fig.12 The ratio of RANKL/OPG Date are presented as±s, n=4;***p<0.001, compared with 0OB0L, ###, p<0.001, compared with 0OB6L

3 討論

骨髓是造血器官，也是各種免疫細胞的發(fā)源地，骨髓中各階段細胞不斷在完成更新、增殖、分化和成熟等發(fā)育過程。其原始階段細胞為多能干細胞，可以形成紅細胞、粒細胞、巨噬細胞等，以及B淋巴細胞和T淋巴細胞。骨髓造血干細胞的分化需要特殊的骨微環(huán)境，骨微環(huán)境主要由各種骨基質(zhì)細胞組成，最主要的是間充質(zhì)干細胞，而成骨細胞系對維持正常的造血功能，特別是為淋巴細胞的發(fā)育提供了不可或缺的支持作用。Runx2和Osterix是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化早期的轉錄因子，這兩種因子的失表達會導致成骨細胞數(shù)目嚴重減少，骨組織缺失，并且伴隨骨髓造血功能低下，淋巴細胞缺失[3-7]。Zhu等[8]又發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的頭蓋骨成骨細胞能充分支持造血干細胞向B淋巴細胞分化發(fā)育的全過程，確認了成骨細胞與B淋巴細胞前體的相互作用。成骨細胞在整個分化過程中是否對淋巴細胞的發(fā)育都有作用，相關的研究表明，只有分化早期的成骨細胞具有支持淋巴細胞分化的作用，而分化成熟的成骨細胞對淋巴細胞分化無明顯影響[9-10]。本研究采用的骨髓淋巴細胞大多為早期不成熟淋巴細胞，因此我們選取早期頭蓋骨成骨細胞與其共培養(yǎng)，從而使成骨細胞支持骨髓淋巴細胞的分化。

近來許多研究顯示，骨免疫參予了類風濕關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、Paget骨病、骨溶解等諸多骨科疾病的發(fā)生與發(fā)展，揭示免疫系統(tǒng)對骨代謝的重要調(diào)節(jié)作用[2]。這種調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)為免疫細胞和骨細胞間通過許多細胞因子（如腫瘤壞死因子TNF-α，白介素 IL-1、3、6、7、11、15、17和 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)）及其受體相互作用。T淋巴細胞對成骨細胞和破骨細胞的刺激或抑制作用與T淋巴細胞亞群、細胞因子和局部因素密切相關。T淋巴細胞激活后產(chǎn)生RANKL、TNF-α和M-CSF，這些因子可促進破骨細胞前體的分化和破骨細胞活化，導致病理性骨吸收增強[11-14]。B淋巴細胞也可表達RANKL，但研究顯示 B淋巴細胞分泌的 RANKL主要是促進B淋巴細胞的增殖和分化。同時細胞學研究表明前B淋巴細胞在RANKL和M-SCF刺激下可分化成破骨樣細胞[15-16]。這樣，免疫系統(tǒng)的兩大主要細胞可通過細胞因子影響骨代謝。

以往大部分的研究結果都集中在免疫細胞對破骨細胞的影響，很少有關免疫細胞對成骨細胞的影響。本研究通過輻照刺激淋巴細胞，與早期成骨細胞共培養(yǎng)后作用于正常成骨細胞，發(fā)現(xiàn)輻照共培養(yǎng)淋巴細胞抑制成骨細胞的分化，堿性磷酸酶活性明顯降低，ALP和OCN的表達也明顯降低。0OB6L組和 6OB6L組較 0OB0L組堿性磷酸酶活性下降15.98%(p<0.01)和28.53%(p<0.001)，ALP基因表達下降 20.96%(p<0.01)和 39.33%(p<0.001)，OCN 基因表達下降19.02%(p<0.05)和40.49%(p<0.001)。同時我們發(fā)現(xiàn)6OB6L組較0OB6L組對成骨細胞分化的抑制作用更明顯，具有統(tǒng)計學意義。以往的研究表明，早期的成骨細胞對淋巴細胞的分化極其重要，但是輻射刺激的淋巴細胞與成骨細胞的相互作用可能并非如生理狀態(tài)，其相互作用的結果使淋巴細胞抑制正常成骨細胞的分化。輻照共培養(yǎng)的淋巴細胞促進了成骨細胞RANKL的表達，RANKL/OPG比值明顯增高。0OB6L組和 6OB6L組較 0OB0L組RANKL/OPG比值上升40.04%(p<0.001)和138.07%(p<0.001)，6OB6L組又較 0OB6L組上升 70.00%(p<0.001)。RANKL是破骨細胞分化和活化的重要因子，RANKL/OPG比值的升高可以顯著促進破骨細胞前體的分化和破骨細胞活化，導致骨吸收增強。

輻照骨髓淋巴細胞抑制成骨細胞分化，其機制可能是通過抑制成骨細胞ALP和OCN的表達；同時輻照淋巴細胞促進成骨細胞 RANKL的表達，RANKL/OPG比值升高，間接促進破骨細胞分化和活化。

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