鎳鈦合金支架抑制單核巨噬細(xì)胞應(yīng)答革蘭陰性菌脂多糖的研究＊

羅海波，呂愛貞，盧 曉，富 寧，吳 砂，鄭 華

（1.廣州軍區(qū)解放軍第421醫(yī)院檢驗(yàn)輸血科，廣州510310；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣州510515）

心血管狹窄引起的冠心病已經(jīng)成為危及人類生命健康的主要疾病之一，向病變血管內(nèi)置入金屬支架，成為目前治療冠狀動(dòng)脈及其他外周動(dòng)脈疾病有效的治療方法［1］。目前常用的材料有鉭、醫(yī)用不銹鋼及鎳鈦合金等。近年來發(fā)現(xiàn)，這些金屬材料支架會(huì)影響單核巨噬細(xì)胞功能，引發(fā)過敏反應(yīng)［2］。但對(duì)單核巨噬細(xì)胞其他功能的影響卻未做深入研究。

單核巨噬細(xì)胞的重要功能之一就是抗感染，通過多種方式能識(shí)別多種病原微生物關(guān)鍵成分，從而發(fā)揮清除病原微生物的目的。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與持續(xù)極為重要，單核巨噬細(xì)胞通過其表面Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）－LPS識(shí)別革蘭陰性菌，誘發(fā)一系列的炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答［3］。本研究利用鎳鈦合金心血管支架（nickel－titanium stent，NTS）作用單核巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞，檢查其影響單核巨噬細(xì)胞應(yīng)答LPS的能力及其胞內(nèi)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路改變，從而探討NTS對(duì)單核巨噬細(xì)胞抗感染能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 PE標(biāo)記抗小鼠FasL、CD80、CD86抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。小鼠IL－6、TNF－α的ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Luciferase Assay購(gòu)自美國(guó)Promega公司。pGL4.32－luc2P／NF－κκB－RE／Hygro Vector購(gòu)自美國(guó)Promega公司。干擾素－γ（GAS）、干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT3）信號(hào)通路質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。不完全培養(yǎng)基RPMI－1640及新生小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胰蛋白酶購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。NTS為荷蘭Orbusneich公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng) Raw264.7細(xì)胞用含10%新生小牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI－1640在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 地塞米松（DX）刺激Raw264.7細(xì)胞 于Raw264.7細(xì)胞中加入10－6mol／L DX培養(yǎng)4d（DX－Raw264.7細(xì)胞）。

1.2.3 NTS刺激Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／mL，于培養(yǎng)的Raw264.7細(xì)胞及DXRaw264.7細(xì)胞中加入NTS培養(yǎng)4d。

1.2.4 LPS刺激經(jīng)支架作用后的Raw264.7細(xì)胞及DXRaw264.7細(xì)胞 于經(jīng)NTS作用后的Raw264.7細(xì)胞及DXRaw264.7細(xì)胞中加入LPS培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍待檢。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／mL，分別標(biāo)記抗體PE－FasL、PE－CD80。4℃孵育30min，PBS洗2遍，加入0.5mL PBS重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞因子檢測(cè) 根據(jù)小鼠IL－6、TNF－α的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL－6和 TNF－α。

1.2.7 信號(hào)通路活化檢測(cè) 鋪板，將每孔的細(xì)胞密度調(diào)整為1×105／mL，按Lipofectamine 2000說明書將pGL4.32［luc2P／NF－κκB－RE／Hygro］Vector、pTA－GAS－luc、pTA－ISRE－luc和pTA－STAT3－luc信號(hào)通路活化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞裂解液，熒光素酶試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 根據(jù)不同處理方式分組 分為：對(duì)照空白組，單純NTS組，單純LPS作用組，NTS作用后LPS反應(yīng)組，RAW264.7組：?jiǎn)魏思?xì)胞系264.7，DX－Raw264.7組：DX作用單核細(xì)胞系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7及DX－Raw264.7細(xì)胞表面共刺激分子的影響 NTS作用后經(jīng)過LPS刺激時(shí)，Raw264.7細(xì)胞CD80的表達(dá)明顯高于LPS單獨(dú)刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而DX預(yù)處理組，NTS影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7及DX－Raw264.7細(xì)胞表達(dá)CD80的影響

2.2 NTS作用后LPS對(duì)單核巨噬細(xì)胞Raw264.7合成促炎癥因子的影響 在NTS單獨(dú)作用下，Raw264.7組分泌IL－6及TNF－α明顯高于空白對(duì)照組，但經(jīng)NTS作用后，應(yīng)對(duì)LPS刺激時(shí)Raw264.7組分泌IL－6明顯低于LPS單獨(dú)刺激組。但Raw264.7組經(jīng)過DX事先處理后，各組IL－6的分泌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而且NTS與LPS對(duì)單核巨噬細(xì)胞的影響都明顯受到了抑制，弱于Raw264.7組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞分泌IL－6及TNF－α的影響

2.3 NTS作用后LPS對(duì)單核巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞表面FasL類分子表達(dá)的影響 經(jīng)NTS作用后，LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞FasL的表達(dá)明顯低于LPS單獨(dú)刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但Raw264.7細(xì)胞經(jīng)過DX事先處理后，DX－Raw264.7細(xì)胞經(jīng)NTS單獨(dú)刺激后，F(xiàn)asL的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組，經(jīng)LPS單獨(dú)刺激后，F(xiàn)asL的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，而低于NTS與LPS共同刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在LPS單獨(dú)刺激下，DX－Raw264.7組表面FasL的表達(dá)明顯高于Raw264.7組，在NTS與LPS共同刺激下，DX－Raw264.7組表面FasL的表達(dá)同樣明顯高于Raw264.7組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞表達(dá)FasL的影響

圖4 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞胞內(nèi)NF－κB信號(hào)通路活化的影響

圖5 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞胞內(nèi)GAS信號(hào)通路活化的影響

圖7 NTS作用后LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞及DX－Raw264.7細(xì)胞胞內(nèi)STAT3信號(hào)通路活化的影響

2.4 NTS作用對(duì)Raw264.7細(xì)胞信號(hào)通路的影響。NTS作用后，明顯抑制LPS對(duì)NF－κB的活化作用，但LPS介導(dǎo)的GAS，ISRE及STAT3等通路無明顯影響。但Raw264.7細(xì)胞經(jīng)過DX事先處理后，NTS單獨(dú)就可活化 NF－κB、GAS、ISRE及STAT3等一系列信號(hào)通路，但鎳鈦合金影響LPS介導(dǎo)的信號(hào)活化，DX－Raw264.7組與Raw264.7組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4～7。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病死亡的重要原因之一，目前主要是通過向動(dòng)脈狹窄部位植入金屬支架，使病變部位動(dòng)脈保持血流暢通以達(dá)到治療疾病的目的［4］。然而，金屬支架作為一種外來異物，植入人體后會(huì)引起機(jī)體免疫功能發(fā)生改變。現(xiàn)已證實(shí)，金屬支架植入后，雖然通過機(jī)械張力短時(shí)間內(nèi)改變血管狹窄，但由于金屬支架可刺激機(jī)體免疫細(xì)胞應(yīng)答，局部形成炎性反應(yīng)，造成支架周邊血管床炎癥，容易形成再狹窄，嚴(yán)重地影響了支架的作用［5］。對(duì)于支架材料的選擇與應(yīng)用一直是一個(gè)難題。在本研究中，證實(shí)了在NTS單純作用下，基本上不引發(fā)單核巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的活化，不產(chǎn)生炎癥因子，這點(diǎn)有利于進(jìn)行術(shù)后恢復(fù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的鎳鈦合金支架作用處出現(xiàn)過敏性炎癥不同，由此似乎可以得到一種比較好的低免疫原性支架材料配比［6］。

單核巨噬細(xì)胞作為重要的吞噬細(xì)胞，對(duì)革蘭陰性菌的吞噬處理是其重要的免疫功能。LPS是革蘭陰性菌重要的胞壁組成成分，能與單核巨噬細(xì)胞表面TLR4分子結(jié)合，刺激免疫反應(yīng)的發(fā)生。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，TLR4是LPS最主要的識(shí)別受體［7］。LPS從細(xì)菌中釋放出來后，會(huì)與血液中的LPS結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，再與巨噬細(xì)胞表面的甘油磷酸肌醇結(jié)合蛋白CD14結(jié)合，接著LPS被轉(zhuǎn)移到TLR4胞外段 MD－2上，刺激巨噬細(xì)胞，使其發(fā)生一系列的反應(yīng)［2］。本研究著重觀察鎳鈦合金影響單核巨噬細(xì)胞對(duì)LPS應(yīng)答的影響，結(jié)果證實(shí)，NTS作用后，單核巨噬細(xì)胞應(yīng)答LPS時(shí)，其表面的殺傷性標(biāo)志FasL及促炎癥因子IL－6的表達(dá)都明顯低于無支架作用時(shí)，說明NTS抑制了Raw264.7細(xì)胞對(duì)LPS的免疫應(yīng)答，表明NTS可能會(huì)抑制單核巨噬細(xì)胞對(duì)革蘭陰性菌的應(yīng)答。對(duì)于單核巨噬細(xì)胞，當(dāng)其通過TLR4與LPS結(jié)合后，會(huì)活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的NF－κB通路［8］。分泌多種促炎癥細(xì)胞因子，如IL－6、TNF－α等，引起一系列的炎性反應(yīng)［9－10］。而鎳鈦合金明顯地抑制了這種LPS介導(dǎo)的NF－κB活化，降低了炎性反應(yīng)。除此以外，對(duì)于感染，干擾素也是重要的抵抗因素，筆者關(guān)注了GAS或ISRE，這兩種與干擾素產(chǎn)生密切相關(guān)的信號(hào)通路的活化嚴(yán)格控制了干擾素的產(chǎn)生［11］，本研究中發(fā)現(xiàn)他們都沒受到影響，由此證實(shí)鎳鈦合金無法影響Ⅰ型及Ⅱ型干擾素的產(chǎn)生。

DX為糖皮質(zhì)激素的一種，具有抗炎、抗過敏等多種藥理作用，被臨床廣泛使用，在避免支架植入后狹窄中經(jīng)常使用，現(xiàn)在已經(jīng)將緩釋DX涂層應(yīng)用于支架的報(bào)道減輕局部炎性反應(yīng)［12］。在本研究中，DX可以明顯改變NTS的作用。DX單獨(dú)作用就可以明顯降低促炎癥因子及相關(guān)炎癥信號(hào)分子的活化，而鎳鈦合金對(duì)LPS介導(dǎo)的NF－κb活化的抑制效應(yīng)也得到了放大，同時(shí)還影響了ISRE及STAT3信號(hào)的活化，進(jìn)一步地抑制了抗炎作用。所以，DX在支架干擾LPS應(yīng)答方面會(huì)加強(qiáng)這種抑制效果，使機(jī)體更難應(yīng)答LPS。

綜上所述，NTS可通過抑制單核巨噬細(xì)胞NF－κB活化阻礙LPS的免疫應(yīng)答，而DX則會(huì)進(jìn)一步放大這種抑制效應(yīng)。此研究有利于從臨床應(yīng)用角度探討NTS的應(yīng)用。

［1］Nakazawa G.Stent thrombosis of drug eluting stent：pathological perspective［J］.J Cardiol，2011，58（2）：84－89.

［2］Kounis NG，Giannopoulos S，Tsigkas GG，et al.Eosinophilic responses to stent implantation and the risk of Kounis hypersensitivity associated coronary syndrome［J］.Int J Cardiol，2012，156（2）：125－132.

［3］Aerbajinai W，Lee K，Chin K，et al.Glia Maturation factor－γnegatively modulates TLR4signaling by facilitating TLR4endocytic trafficking in macrophages［J］.J Immunol，2013，190（12）：6093－6103.

［4］Cecchi E，Giglioli C，Valente S，et al.Role of hemodynamic shear stress in cardiovascular disease［J］.Atherosclerosis，2011，214（2）：249－256.

［5］Simon DI.Inflammation and vascular injury：basic discovery to drug development［J］.Circ J，2012，76（8）：1811－1818.

［6］Kounis NG，Giannopoulos S，Tsigkas GG，et al.Eosinophilic responses to stent implantation and the risk of Kounis hypersensitivity associated coronary syndrome［J］.Int J Cardiol，2012，156（2）：125－132.

［7］Rubinow KB，Wall VZ，Nelson J，et al.Acyl－CoA synthetase 1is induced by Gram－negative bacteria and lipopolysaccharide and is required for phospholipid turnover in stimulated macrophages［J］.J Biol Chem，2013，288（14）：9957－9970.

［8］Schilling JD，Machkovech HM，He L，et al.Palmitate and lipopolysaccharide trigger synergistic ceramide production in primary macrophages［J］.J Biol Chem，2013，288（5）：2923－2932.

［9］Zhang DY，Chen LL，Li SL，et al.Lipopolysaccharide（LPS）of Porphyromonas gingivalis induces IL－1beta，TNF－alpha and IL－6production by THP－1cells in a way different from that of Escherichia coli LPS［J］.Innate Immun，2008，14（2）：99－107.

［10］Ogawa Y，Tasaka S，Yamada W，et al.Role of Toll－like receptor 4in hyperoxia－induced lung inflammation in mice［J］.Inflamm Res，2007，56（8）：334－338.

［11］Yu JH，Zhu BM，Wickre M，et al.The transcription factors signal transducer and activator of transcription 5A（STAT5A）and STAT5Bnegatively regulate cell proliferation through the activation of cyclin－dependent kinase inhibitor 2b（Cdkn2b）and Cdkn1aexpression［J］.Hepatology，2010，52（5）：1808－1818.

［12］K?nig A，Leibig M，Rieber J，et al.Randomized comparison of dexamethasone－eluting stents with bare metal stent implantation in patients with acute coronary syndrome：serial angiographic and sonographic analysis［J］.Am Heart J，2007，153（6）：979.