不同劑量四氯化碳誘導(dǎo)家兔肝纖維化模型的建立＊

丁 可，劉滿榮，吳奇新，唐建華，曾陽東，馬 宇

（1.廣西壯族自治區(qū)南寧市第二人民醫(yī)院放射科 530031；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣西桂林541001；3.廣西壯族自治區(qū)南寧市第二人民醫(yī)院超聲科 530031；4.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，廣西桂林541001）

肝纖維化主要表現(xiàn)為肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織的異常增生和沉積，是慢性肝病的重要病理特征，也是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。肝纖維化向肝硬化發(fā)展是一個(gè)潛隱漸進(jìn)而可逆的過程［1－2］，晚期肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)，因此，及時(shí)阻斷肝纖維化發(fā)展成為慢性肝病防治中的關(guān)鍵問題［3］。肝纖維化動物模型的建立是開展肝纖維化防治研究的重要手段，也是進(jìn)行人體研究的前提［4］。因飼養(yǎng)簡單及肝臟大小適中，家兔為常用的肝纖維化動物模型；以CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型為國內(nèi)應(yīng)用最多的造模方法［5］，但不同劑量CCl4的造模效果有所不同。本實(shí)驗(yàn)擬探討CCl4誘導(dǎo)建立家兔纖維化模型的最佳劑量，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選用6個(gè)月齡雄性健康新西蘭大白兔50只，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為5組，每組10只。所有家兔均飼養(yǎng)在層疊式不銹鋼絲籠中，飼喂由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供的基礎(chǔ)顆粒狀飼料，自由飲用自來水。兔房通風(fēng)良好，保持清潔，溫度20～29℃，空氣濕度50%～70%。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及肝穿刺活檢槍 實(shí)驗(yàn)試劑：分析純CCl4（含量≥99.5%），廣東西隴化工股份有限公司生產(chǎn)。肝穿刺活檢槍：半自動型活檢針，規(guī)格型號“18GL－130mm”，制造廠商為日本TSK株式會社。

1.2.2 模型制作 分籠正常喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后開始進(jìn)行造模。將實(shí)驗(yàn)家兔分為5組：0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組，根據(jù)體質(zhì)量分別給予相應(yīng)劑量的分析純CCl4進(jìn)行每周2次的皮下注射。分別于給藥后的第4、8周，在B超引導(dǎo)下行肝右前葉穿刺活檢術(shù)，注意避開肝臟大的血管和膽管，標(biāo)本長約1.5～2.0cm。造模中途死亡的家兔立即取其肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。造模后的第12周，采用耳緣靜脈注射空氣栓塞法處死存活的所有實(shí)驗(yàn)兔，取大小約1.5cm×1.0cm×0.3cm的肝臟標(biāo)本送病檢。

表1 各組家兔用藥后1～12周死亡情況

1.2.3 病理學(xué)檢查 對所有肝臟標(biāo)本分別進(jìn)行蘇木精－伊紅（HE）及Masson三色染色病理學(xué)檢查。以2000年西安會議方案為標(biāo)準(zhǔn)［6］，根據(jù)纖維組織增生情況，將肝纖維化分為S0～S45期，動態(tài)觀察CCl4誘導(dǎo)建立家兔肝纖維化模型過程中的肝組織病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組家兔死亡率及肝纖維化成模率的比較采用χ2檢驗(yàn)，組間行χ2分割計(jì)算，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔用藥后的死亡情況 各組家兔用藥后1～12周死亡情況見表1。CCl4的給予劑量大于1.0mL／kg時(shí)，家兔死亡率顯著增高（≥70%），與前兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；26只家兔死亡發(fā)生在3周之內(nèi)，5周之后趨于穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)25只家兔死亡發(fā)生在給藥后24～48h，其余6只則發(fā)生于肝穿刺后的數(shù)天。死亡兔的肝臟病理顯示：0.5 mL／kg劑量組第5周死亡兔的肝臟伴有脂肪變，1.0mL／kg劑量組8周死亡兔的肝臟可見纖維化形成，2.0mL／kg劑量組9周死亡兔的肝臟顯示肝纖維化，5.0mL／kg劑量組7周死亡兔的肝臟可見大片壞死伴有纖維化，其余死亡家兔僅可見不同程度的肝細(xì)胞腫脹、壞死，均無肝纖維化形成。

2.2 各組家兔用藥后肝纖維化只數(shù)及建模成功率 0.2mL／kg組第12周存活兔最多，但只有6只可見肝纖維化形成，建模成功率為60%，其中僅有2只發(fā)展為肝硬化（G4S4），另外4只中，2只為 G1S1，G1～2S2和 G3S3各1只。0.5mL／kg劑量組第12周存活兔為7只，但7只均成功建立起肝纖維化模型，故建模成功率最高，達(dá)70%，且其中的5只已經(jīng)發(fā)展至肝硬化（G4S4），2只家兔中 G2～3S2和 G3S3各1只）。其余3組建模成功率都較低，且劑量越大成功率越低。后3組肝纖維化成模率顯著低于前2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組家兔用藥后肝纖維化只數(shù)及建模成功率

3 討 論

氯化烷烴類化合物CCl4是一種選擇性肝毒性藥物，給予長期反復(fù)的CCl4刺激可誘導(dǎo)肝纖維化形成［7］。用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型具有成模時(shí)間短、簡便、價(jià)廉、重復(fù)性好及病理特征穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，在形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)的某些方面與人肝纖維化相似，如兩者均有肝細(xì)胞壞死后的再生，實(shí)驗(yàn)動物表現(xiàn)的體征及肝功能異常與人慢性肝病進(jìn)展為肝硬化時(shí)相似，因而成為國內(nèi)應(yīng)用最多的造模方法［5］。本研究顯示，家兔肝纖維化的嚴(yán)重程度與炎癥關(guān)系密切，肝纖維化的程度（病理分期）越重，其炎癥活動度（病理分級）也就越大，說明家兔肝纖維化模型的病理學(xué)分級與病理分期呈正相關(guān)關(guān)系，這與人的慢性肝?。卫w維化的病理學(xué)特點(diǎn)相似，可見CCl4誘導(dǎo)建立家兔肝纖維化模型的良好效果。用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型可廣泛應(yīng)用于肝纖維化發(fā)生機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物與組織病理的相關(guān)性及抗纖維化藥物的篩選等研究。

CCl4誘導(dǎo)建立肝纖維化模型的途徑有口服、腹腔注射和皮下注射等，多位學(xué)者采用皮下注射的方法成功建立起大鼠的肝纖維化／肝硬化模型［8－9］。周賢等［9］將 Wistar大鼠隨機(jī)分成血清組、CCl4皮下注射組、CCl4腹腔注射組進(jìn)行肝纖維化造模，研究顯示CCl4皮下注射組制備肝纖維化模型的動物死亡率較低，肝纖維化形成時(shí)間較短，是一種制作肝纖維化模型較好的方法。劉滿榮等［10］通過不同給藥途徑建立家兔肝纖維化模型的對比研究亦認(rèn)為，皮下注射法CCl4造模是制作肝纖維化模型的最佳給藥途徑。CCl4進(jìn)入體內(nèi)15min即可引起肝細(xì)胞損害，至48h達(dá)到高峰，隨后進(jìn)入修復(fù)階段。1～2d給藥一次容易導(dǎo)致動物急性中毒死亡，而給藥間隔超過4～5d時(shí)，肝臟可通過較強(qiáng)的肝細(xì)胞再生等修復(fù)機(jī)制迅速恢復(fù)肝功能，因此，有效維持CCl4肝損傷效果的最適合給藥間隔時(shí)間為3 d［11］。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用皮下注射的方法進(jìn)行造模，并確定給藥頻率為每周2次。

CCl4為選擇性肝劇毒藥物，其肝毒性作用迅速而劇烈，進(jìn)入體內(nèi)48h肝細(xì)胞損害達(dá)到高峰，易導(dǎo)致動物急性中毒而死亡，故實(shí)驗(yàn)中家兔死亡多發(fā)生于給藥后的1～2d。經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)期，動物對CCl4的耐受性相對增強(qiáng)，所以家兔死亡多發(fā)生在造模后3周之內(nèi)，5周之后趨于穩(wěn)定。另有6只家兔于肝穿刺后的數(shù)天死亡，穿刺前的實(shí)驗(yàn)室檢查均顯示肝功能下降明顯，病理標(biāo)本可見不同程度肝細(xì)胞腫脹、壞死伴有出血，故考慮與實(shí)驗(yàn)兔受藥后體質(zhì)下降，肝功能損害導(dǎo)致易出血傾向或穿刺后急性創(chuàng)傷有關(guān)。

CCl4成模時(shí)間由給藥途徑和劑量決定，一般造模時(shí)間為8周至4個(gè)月［12］。Chang等［13］的研究表明，CCl4誘導(dǎo)小鼠肝硬化形成的時(shí)間主要取決于CCl4的劑量，增加劑量可以縮短造模時(shí)間，但同時(shí)使死亡率大大增加，因而在常用且安全有效的皮下注射造模法中，探討建立肝纖維化模型的最佳CCl4劑量實(shí)屬必要。1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組的家兔死亡率都很高，至12周時(shí)的死亡率分別高達(dá)70%、90%和100%，顯著高于0.2mL／kg劑量組的20%和0.5mL／kg劑量組的30%，可見CCl4的肝臟毒性作用隨著劑量的增加而增大，安全造模的CCl4給予劑量應(yīng)該小于1.0mL／kg體質(zhì)量，否則極易導(dǎo)致家兔急性中毒而死亡。由于死亡率較高，故1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組的肝纖維化成模率都較低，僅分別為40%、20%和10%，顯著低于0.2mL／kg劑量組的60%和0.5mL／kg劑量組的70%成模率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，0.5mL／kg劑量組的肝纖維化和肝硬化成模時(shí)間都要短于0.2mL／kg劑量組，由此可見，在安全有效造模的前提下，0.5mL／kg劑量的CCl4更易誘導(dǎo)建立肝纖維化／肝硬化模型，可視為建立家兔纖維化模型的最佳CCl4劑量。

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