PTTG和VEGF－C在喉癌組織中的表達(dá)及其與微淋巴管生成的關(guān)系

高 珊，盧國(guó)友，王竹君△，徐 勤，辛國(guó)華，劉吉娜，黃越燕

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河北承德067000；2.河北省承德市口腔醫(yī)院綜合科067000）

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要病理類(lèi)型為鱗狀細(xì)胞癌，其發(fā)病率逐年上升，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移成為影響其預(yù)后的主要原因。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）是從垂體瘤組織中分離出的原癌基因，其高表達(dá)在促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化以及體內(nèi)腫瘤形成中有重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子－C（VEGF－C）是目前發(fā)現(xiàn)的惟一可調(diào)節(jié)胚胎組織淋巴管生成的因子，是PTTG反式激活靶基因之一，可作為PTTG介導(dǎo)微淋巴管生成的效應(yīng)劑。本研究檢測(cè)PTTG和VEGF－C在60例喉鱗癌組織中的表達(dá)及其與微淋巴管生成的關(guān)系，探討二者對(duì)喉癌發(fā)生、發(fā)展的作用及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例喉癌組織及32例喉癌相應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤切緣至少大于0.5cm［1］）取自2005年6月至2011年12月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科住院手術(shù)60例原發(fā)喉鱗癌患者。術(shù)前均未接受放、化療，標(biāo)本為手術(shù)切除后1h內(nèi)獲得，標(biāo)本獲得后經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、4μm厚度連續(xù)切片。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查確診。60例喉鱗癌患者中，男52例，女8例；年齡42～74歲，中位年齡60歲，＜60歲33例，≥60歲27例；采用2010年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）公布的TNM分類(lèi)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期24例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例（有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)術(shù)后病理而定）；聲門(mén)上型30例，聲門(mén)型30例；發(fā)病前吸煙史20年以上（每日大于20支）者48例為吸煙組，其余12例為對(duì)照組；腫瘤小于3cm者40例，腫瘤大于或等于3cm者20例；高分化（G1級(jí)）35例，中低分化（G2～G3級(jí)）25例。

1.2 試劑和儀器耗材 兔抗人PTTG、VEGF－C多克隆抗體及鼠抗人D2－40單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法，每例標(biāo)本解凍后經(jīng)甲醛固定24h內(nèi)行石蠟包埋，連續(xù)切取切片3張，分別進(jìn)行PTTG、VEGF－C和D2－40染色石蠟切片（5μm），常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min，抗原修復(fù)15min，室溫放置40 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，小牛血清封閉10min，滴加一抗50μL（1∶100工作液）4℃過(guò)夜，PBS沖洗，加二抗，室溫孵育15min，PBS沖洗，DAB顯色5min，終止顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，透明，封片，鏡檢。

1.4 結(jié)果判定 PTTG、VEGF－C主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)），以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知喉癌陽(yáng)性組織切片為陽(yáng)性對(duì)照。采用Volm雙評(píng)分法進(jìn)行判定在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5個(gè)高倍鏡視野（×200）：（1）按染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率（A值）評(píng)分，陰性為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分；（2）按染色強(qiáng)度（B值）評(píng)分，不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合A、B值判斷結(jié)果，陰性：0分，陽(yáng)性：1～6分。

微淋巴管密度（LMVD）判定：采用D2－40染色微淋巴管內(nèi)皮，陽(yáng)性的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。微淋巴管計(jì)數(shù)根據(jù)Weidener法，先用100倍鏡掃視整個(gè)切片，尋找腫瘤組織內(nèi)微淋巴管最豐富的區(qū)域即“熱點(diǎn)”，然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)每一熱點(diǎn)的微淋巴管數(shù)目（忽略管徑大于8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的脈管），由兩人采用雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果采用2個(gè)熱點(diǎn)、5個(gè)200倍視野下微血管數(shù)目的平均值作為L(zhǎng)MVD。以上結(jié)果的判定均由兩位不知患者臨床病理資料的病理科醫(yī)師進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析蛋白，LMVD表達(dá)的相關(guān)性。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以x±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTTG、VEGF－C蛋白在喉癌組織、癌旁組織中均有表達(dá)

在60例喉癌組織標(biāo)本中，PTTG蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為70.0%，在癌旁組織表達(dá)的陽(yáng)性率37.5%，PTTG蛋白在喉癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGF－C在喉癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為68.33%，在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率12.5%，VEGF－C蛋白在喉癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖1、2。

表1 喉癌組織、癌旁組織中PTTG、VEGF－C蛋白表達(dá)的比較［n（%）］

圖1 PTTG蛋白在喉癌組織中表達(dá)（SP×400）

2.2 LMVD在喉癌組織、癌旁組織中的表達(dá) 喉癌組織LM－VD值在高倍視野下為（23.08±3.14），明顯高于癌旁組織（14.71±2.50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 VEGF－C蛋白在喉癌組織中的表達(dá)（SP×400）

圖3 D2－40在組織中表達(dá)（SP×200）

2.3 PTTG、VEGF－C的表達(dá)與喉癌組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度的關(guān)系 PTTG、VEGF－C的表達(dá)均與喉癌組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度相關(guān)（P＜0.05），與喉癌組織中的腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。LMVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05），與臨床分期、分化程度、腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 PTTG、VEGF－C在喉癌組織表達(dá)的相關(guān)性 PTTG表達(dá)陽(yáng)性的42例喉癌組織中，VEGF－C陽(yáng)性31例（73.81%）；VEGF－C表達(dá)陽(yáng)性的41例喉癌組織中，PTTG陰性34例（82.93%）。PTTG與VEGF－C在喉癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.67，P＜0.05）。

2.5 喉癌組織中PTTG、VEGF－C表達(dá)各組的LMVD值比較

喉癌組織中VEGF－C表達(dá)陽(yáng)性組LMVD值（27.83±4.03），顯著高于VEGF－C陰性表達(dá)組LMVD值（23.53±3.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTTG表達(dá)陽(yáng)性組LMVD值（27.63±4.81），高于 PTTG 表達(dá)陰性組 LMVD值（24.59±4.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

PTTG作為原癌基因，在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，除在垂體腫瘤中有高表達(dá)外，其他的惡性腫瘤細(xì)胞中也高表達(dá)［1－3］。PTTG高表達(dá)在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制可能有：（1）PTTG通過(guò)激活轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的C－myc原癌基因從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用［4］；（2）PTTG在腫瘤組織中的高表達(dá)可以促進(jìn)bFGF轉(zhuǎn)錄和分泌，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤中出現(xiàn)有絲分裂、血管生成、調(diào)控激素分泌［5］；（3）PTTG蛋白抑制姊妹染色體單體分離，破壞細(xì)胞分裂導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性破壞，非整倍體形成，賦予其成瘤活性［6］；（4）PTTG通過(guò)反式激活作用激活原癌基因、生長(zhǎng)因子等間接致癌；（5）PTTG基因調(diào)控區(qū)的突變引起其調(diào)控失常，導(dǎo)致其高表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化；（6）PTTG具有細(xì)胞凋亡和染色體非整倍體性的雙重作用。以上決定了PTTG與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。

目前，對(duì)于腫瘤淋巴管生成的研究已成為熱點(diǎn)，VEGF－C被認(rèn)為是已知最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激因子，其高表達(dá)可促進(jìn)淋巴管增生及淋巴道轉(zhuǎn)移［7］。VEGF－C是具有高度特異性的血管內(nèi)皮分裂原，可誘導(dǎo)血管新生病增加新生血管的通透性。VEGF－C可能通過(guò)促進(jìn)淋巴管形成并增生，從而增加淋巴管與腫瘤細(xì)胞接觸面積使之利于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，同時(shí)通過(guò)淋巴管數(shù)目的增加及接觸面積的加大產(chǎn)生擠壓現(xiàn)象使淋巴管通透性和腫瘤間質(zhì)間的壓力增加，更利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管及靜脈血管［8］。Wiericnkx等［1］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤邊緣區(qū) LMVD增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。王璟璐等［9］發(fā)現(xiàn)，VEGF－C不僅與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Duke′s分期相關(guān)，還與癌組織中LMVD密切相關(guān)。Tes等［10］在喉鱗癌組織中通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)到VEGF－C高表達(dá)。大量研究證實(shí)，PTTG可以上調(diào)DNA結(jié)合抑制蛋白－3（ID3），而VEGF－C介導(dǎo)血管發(fā)生的最重要介質(zhì)就是ID3，PTTG促進(jìn)VEGF－KDR－ID3自分泌途徑，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［11－12］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PTTG 與VEGF－C顯著正相關(guān)相印證。本研究還顯示，隨著PTTG表達(dá)的增高，VEGF－C與LMVD表達(dá)亦增強(qiáng)，且喉癌組中VEGF－C表達(dá)明顯高于癌旁組，且PTTG、VEGF－C及LMVD與喉鱗癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度密切相關(guān)。提示在喉癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中PTTG、VEGF－C發(fā)揮了重要作用，筆者推測(cè)該機(jī)制可能是PTTG高表達(dá)后通過(guò)上調(diào)生長(zhǎng)因子受體從而誘導(dǎo)VEGF－C表達(dá)增高，即正性調(diào)節(jié)，而VEGF－C表達(dá)增高又通過(guò)刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目和面積增生，從而擠壓遷移促進(jìn)癌組織中腫瘤微淋巴管大量生成及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。PTTG誘導(dǎo)VEGF－C表達(dá)的作用機(jī)制可能為：MAPK級(jí)聯(lián)活化增強(qiáng)PTTG反式激活作用，促進(jìn)PTTG轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，PTTG入核后結(jié)合于 VEGF－C轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，繼而激活VEGF－C轉(zhuǎn)錄、翻譯，促進(jìn)腫瘤微血管淋巴管生成［13］。

本研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)喉癌組織中PTTG、VEGFC的表達(dá)以及腫瘤微淋巴管密度關(guān)系，結(jié)果顯示，PTTG、VEGF－C在喉癌組織中呈顯著正相關(guān)表達(dá)關(guān)系，二者表達(dá)與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度密切相關(guān)。同時(shí)，PTTG、VEGF－C高表達(dá)的喉癌組織中LMVD也高的結(jié)果說(shuō)明該喉癌組織內(nèi)存在大量微淋巴管增生現(xiàn)象，且多位于腫瘤間質(zhì)，LMVD與喉癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，PTTG、VEGF－C可作為喉癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)判標(biāo)準(zhǔn)。如能通過(guò)某種途徑抑制PTTG表達(dá)可降低喉癌的侵襲力及抑制VEGF－C過(guò)度表達(dá)，從而減少癌細(xì)胞通過(guò)淋巴道轉(zhuǎn)移的概率。以上或能為喉癌基因靶點(diǎn)治療研究提供一定的思路。

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