廈門市副溶血性弧菌的脈沖場電泳分析及數(shù)據(jù)庫建立

翁琴云+++游小偉+++張建梅+++黃建煒

[摘要] 目的 建立廈門市副溶血性弧菌分離株的脈沖場凝膠電泳（PFGE）數(shù)據(jù)庫，分析不同來源菌株的同源性關系。 方法 203株菌株的基因組DNA經(jīng)SfiⅠ酶切、脈沖場電泳后，利用Bionumerics軟件分析電泳圖譜。 結果 203株菌株可分成149種不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有獨特的帶型，同時也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多。對于日常監(jiān)測中分離得到的菌株，PFGE分型結果與水產(chǎn)品的種類、采樣時間基本無相關性，79個菌株可分成74個PFGE帶型；從歷年食物中毒應急監(jiān)測中分離得到的菌株，其PFGE型相對較少，124株中只有76個PFGE型。應用Bionumerics計算D值為99.81%。 結論 建立了廈門市副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫，為本市副溶血性弧菌的監(jiān)測和疫情的應急處理提供了科學依據(jù)。

[關鍵詞] 副溶血性弧菌；脈沖場凝膠電泳；分子分型

[中圖分類號] R378.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）08（a）-0007-04

Molecular analysis and database establishment of Vibrio parahaemolyticus by pulsed field gel electrophoresis in Xiamen

WENG Qin-yun YOU Xiao-wei ZHANG Jian-mei HUANG Jian-wei

Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City，Xiamen 361021，China

[Abstract] Objective To establish pulsed field gel electrophoresis（PFGE）database of Vibrio parahaemolyticus and to analyse the homology during the strains from different sources. Methods The DNA samples of 203 Vibrio parahaemolyticus strains were digested with SfiⅠand then were analyzed by PFGE and bionumerics software. Results 203 strains were divided into 149 distinctive PFGE patterns 91.13% （185 strains） of strains owned unique PFGE pattern，and a few of strains owned more strains.79 strains from surveillance were divided into 74 PFGE patterns，which indicated that there was no relationship between the typing results and aquatic product，sampling time.124 strains from food poisoning were divided into 76 PFGE patterns.The D value was 99.81% calculated by bionumerics software. Conclusion The PFGE database of Vibrio parahaemolyticus in Xiamen is established，which providing scientific basis for surveillance and emergency response of Vibrio parahaemolyticus in the city.

[Key words] Vibrio parahaemolyticus；Pulsed field gel electrophoresis；Molecular typing

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性弧菌，廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中，進食含有該菌的食物，可引起嚴重的胃腸炎反應[1]，目前是我國沿海地區(qū)常見的食物中毒病原菌。脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術是一種非常重要且應用廣泛的分子分型技術，可用于評價副溶血性弧菌菌株之間的遺傳多樣性及來源于環(huán)境的菌株與分離自患者菌株的相關性[2-3]。廈門地處沿海，在食源性致病菌日常監(jiān)測中經(jīng)常可從外環(huán)境各種水體和水產(chǎn)品中分離到副溶血性弧菌菌株，同時在本地暴發(fā)的多起食物中毒應急檢測中分離得到副溶血性弧菌菌株。本項目采用PFGE技術對本實驗室歷年從日常檢測與食物中毒應急事件中分離得到的203株副溶血性弧菌菌株進行分析研究，建立廈門市副溶血性弧菌PFGE數(shù)據(jù)庫，有利于從分子水平上了解本市副溶血性弧菌的環(huán)境菌株與分離自患者菌株的特征及其相互關系。

1 材料與方法

1.1 菌株

2005年5月～2012年11月本實驗室在日常監(jiān)測及食物中毒中分離得到的203株副溶血性弧菌分離株，其中有79株是在日常監(jiān)測中分離得到，另外124株是在歷年的食物中毒應急檢測中分離得到。

1.2 主要試劑和儀器

蛋白酶K（Merck公司）；脈沖場電泳級瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（Lonza公司）；限制性內(nèi)切酶：SfiⅠ、XbaⅠ（NEB公司）；脈沖場電泳儀為CHEF MAPPER（Bio-Rad公司）；Densimat細菌濁度儀（BioMerieux公司）；凝膠成像儀為Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法

根據(jù)PulseNet網(wǎng)絡實驗室推薦的標準方法進行PFGE實驗。

1.3.1 膠塊制備 從檢測培養(yǎng)基上挑取單菌落，無菌接種于3% TSA平板上，37℃培養(yǎng)14～18 h。從培養(yǎng)皿上刮取適量細菌，均勻懸濁于細胞懸浮液（CSB）中于濁度儀上調(diào)整細菌的濃度，使OD值為4～4.5。取400 ml菌懸液加入終濃度為0.5 mg/ml蛋白酶K進行消化，再加入等體積1% SeaKem Gold Agarose，混勻灌制膠塊。

1.3.2 細胞裂解和膠塊的洗滌 凝固后膠塊加入細胞裂解液（CLB）/蛋白酶K混合液，置于54℃水浴輕搖2 h后，用50℃預熱的滅菌超純水洗滌2次，再用50℃預熱TE緩沖液洗滌4次。

1.3.3 膠塊DNA酶切 切取2 mm寬的副溶血性弧菌膠塊，用SfiⅠ酶處理，于50℃酶消化4 h，沙門菌H9812用XbaⅠ酶切，于37℃酶消化4 h。

1.3.4 加樣和電泳 將酶切后的膠塊直接粘在梳子齒上，向膠槽中注入100 ml溶化的1% SeaKem Gold Agarose，待膠凝固后進行電泳。設置電泳緩沖液的溫度為14℃，電泳參數(shù)：78～396 kb、10～35.3 s、19 h。

1.3.5 圖像獲取及數(shù)據(jù)分析 電泳結束后，將膠放入Gelred染料中染色，脫色后用Gel Doc XR+成像，使用BioNumerics（6.6.4）軟件，選擇Dice相關系數(shù)和UPGMA方法，設置tolerance為1.5%，對PFGE圖譜進行處理和聚類分析。同時，使用Simpson差異指數(shù)（D值）對PFGE分型結果進行評價。本實驗中的菌株帶型均按照國際PulseNet的帶型命名原則進行命名。

2 結果

2.1 PFGE分型結果

203株副溶血性弧菌經(jīng)過PFGE分析，獲得149個不同的PFGE帶型，命名為VPAS12.XM0001～VPAS 12.XM0149。圖1是每個PFGE型各選取1個代表株的聚類圖，可看出DNA條帶分子量主要集中于30～700 kb，酶切條帶數(shù)為14～21。優(yōu)勢型別有VPAS12.XM0105，共含有14個菌株；VPAS12.XM0124含有8個菌株；VPAS12.XM0113、VPAS12.XM0121、VPAS12.XM0125，都含有6個菌株；VPAS12.XM011有4個菌株。優(yōu)勢型別所含有的絕大多數(shù)菌株都是從食物中毒應急檢測中分離得到，只有VPAS12.XM0105中有1個菌株來源于日常監(jiān)測。應用Bionumerics計算D值為99.81%。

2.2 對廈門副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫總體描述

將本實驗中所獲得的203株副溶血性弧菌的PFGE圖譜，全部錄入Bionumerics軟件中，建立了廈門市副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫。整個數(shù)據(jù)庫共包含79株從日常監(jiān)測中分離得到菌株及124株從歷年食物中毒應急檢測中分離得到的菌株，共獲得149個PFGE型別，其中91.13%（185株）的菌株具有獨特的帶型，同時也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多，含有最多菌株（14株）的優(yōu)勢型別只有VPAS12.XM0105（圖2）。

圖2 各種PFGE帶型包含的菌株數(shù)分布情況

從菌株來源看，對于日常監(jiān)測中分離得到的菌株，PFGE分型結果與水產(chǎn)品的種類、采樣時間基本無相關性，79個菌株可分成74個PFGE帶型，各帶型包含的菌株數(shù)最多3個菌株。對于從歷年食物中毒應急監(jiān)測中分離得到的菌株，其PFGE型相對較少，124株中只有76個PFGE型，各帶型包含的菌株數(shù)最多13個菌株（表1）。

表1 副溶血性弧菌2種不同來源的菌株PFGE帶型的情況描述

3 討論

應用傳統(tǒng)的血清型分型和噬菌體分型方法對副溶血性弧菌進行分型，只能進行表型鑒定，存在分辨力、靈敏度不高等諸多缺陷[4]，PFGE分型方法是一種基于基因水平的分子分型方法，因其具有高分辨力、可重復性、穩(wěn)定性等特點，目前已成為分子分型的“金標準”。1996年在美國首先成立的PulseNet網(wǎng)絡就是利用標準化的分子分型技術（PFGE技術是其中最重要的方法之一），通過菌株“指紋圖譜”或序列資料的比對分析，識別傳染病病例間的內(nèi)在遺傳關聯(lián)，進而追溯傳染病暴發(fā)來源和傳播途徑[5]。美國PulseNet成立之后，多次對以食源性病原體為主的細菌進行監(jiān)測，且在多次食物中毒的調(diào)查中發(fā)揮了良好作用[6-8]。PulseNet China自2004年成立之后，也先后參與國內(nèi)外多個疫情的協(xié)查與處理[6]，因此，本研究在預防和控制突發(fā)食源性疾病公共衛(wèi)生事件中意義重大。

本項目中203株菌株可分成149種不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有獨特的帶型，同時也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多，但包含最多的優(yōu)勢型別VPAS12.XM0105，也只含有14個菌株，其中只有1個菌株是來源于日常監(jiān)測。79個菌株可分成74個PFGE帶型，各帶型包含的菌株數(shù)最多3個菌株。眾多型別的出現(xiàn)，說明了從日常監(jiān)測中得到的廈門地區(qū)副溶血性弧菌菌株存在遺傳多樣性，而且變異度較大，與相關報道結果一致[2，9-10]。個別菌株間存在同源性，其中FJXM11VPA004和FJXM11VPA006圖譜完全相同，屬于同一個帶型，命名為VPAS12.XM0096。這兩個菌株采樣時間、采樣地點、采樣種類都不一樣，提示可能有相同的污染來源，所以仍應加強對副溶血性弧菌的日常監(jiān)測，從而有效預防食源性疾病的發(fā)生。對于從歷年食物中毒應急監(jiān)測中分離得到的124株菌株，其聚類分析結果表明，各個菌株之間的相似度較高，總的可分成76個PFGE型，同一次食物中毒應急檢測中分離得到的菌株，其指紋圖譜大多數(shù)一致或高度相似，但也有的指紋圖譜相差較大，這與食物中毒是由單一血清型感染或多血清感染具有很大關系。研究表明，食物中毒中同一患者分離到多種血清型，不同患者分離到不同種血清型[11-12]或剩余食品和患者可以分離到不同血清型的副溶血性弧菌均有可能[13-14]。

從菌株來源來看，79株從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無關。

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[14] 鄧冬云，梁景濤，楊啟，等.多型別副溶血性弧菌引起的食物中毒病原學分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（4）：776-778.

（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）

從菌株來源來看，79株從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無關。

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（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）

從菌株來源來看，79株從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個從日常監(jiān)測中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無關。

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[14] 鄧冬云，梁景濤，楊啟，等.多型別副溶血性弧菌引起的食物中毒病原學分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（4）：776-778.

（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）