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    貂源C型綠膿桿菌的分離鑒定及其藥敏試驗

    2014-09-25 07:09:44劉佳卉秦緒偉張澤林齊魯動物保健品有限公司山東濟南250100
    山東畜牧獸醫(yī) 2014年1期
    關(guān)鍵詞:綠膿桿菌水貂出血性

    劉佳卉 秦緒偉 趙 遠 張澤林 (齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100)

    綠膿桿菌,是引起水貂出血性肺炎的主要病原菌。該病多發(fā)于溫暖潮濕的夏秋兩季,最適宜生長溫度為30~37℃,可感染眾多哺乳動物、禽類、爬行類和魚類[1],發(fā)病急,死亡快,水貂死亡肺部呈現(xiàn)出嚴重的病理變化。此病的死亡率非常高,目前已成為嚴重阻礙我國水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的烈性傳染病之一,本研究從臨床病死水貂中分離鑒定得到一株綠膿桿菌,并對其進行了耐藥性分析,為地區(qū)性水貂出血性肺炎的防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 采集來自山東諸城某一水貂養(yǎng)殖場暴發(fā)的水貂出血性肺炎的水貂,水貂換毛期間,口鼻流血死亡,血清平板細菌分離獲得菌株。

    1.2 陽性血清和其他材料 G型、B型、C型綠膿桿菌陽性血清購自日本力生研株式會社;營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司;微量生化試劑管購自北京路橋技術(shù)有限責任公司;藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司。

    1.3 細菌分離純化 無菌條件下對病死水貂肺臟劃線,接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長出單菌落后挑取菌落進行純培養(yǎng)。

    1.4 分離菌的生化鑒定 參照中華人民共和國國家標準GB 7918.4-87《化妝品微生物標準檢驗方法》,對分離純化的疑似菌株進行生化鑒定,包括十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)試驗、染色鏡檢、氧化酶試驗、綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、明膠液化試驗、42℃生長試驗。

    1.5 分離菌的分子生物學鑒定 參考文獻,設(shè)計一對引物進行PCR檢測。上游:5’-ACGGGTGAG TAATGCC-3’,下游:5’-CAGTCTCCTTAGAGT GCC-3’,擴增片段長度為1051bp。PCR采用25μl體系,取1.5μl樣品作為模板,加入10×Ex Taq Buffer2.5μl,上、下游引物各0.2μl,dNTP2μl、最后加Ex Taq酶0.2μl,用滅菌純水補足到25μl。擴增條件為:94℃4min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,30次循環(huán);72℃10min。

    1.6 分離菌的血清型鑒定 分別取綠膿桿菌陽性血清G型、B型、C型一滴,滴于載玻片上,用接種環(huán)取營養(yǎng)瓊脂上菌落與血清混合,1min過后觀察有無凝集。

    1.7 分離菌的藥敏試驗 從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落,均勻密集劃線接種于血清營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,按K-B紙片法測定該菌其對常用抗菌藥物的敏感性。

    1.8 分離菌的毒力試驗 從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落,接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,細菌計數(shù),100倍稀釋腹腔注射16~20g小白鼠3只,0.3ml/只,對照注射生理鹽水2只,觀察7d。

    2 結(jié)果

    2.1 細菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果 分離的細菌在血清肉湯培養(yǎng)基上形成圓形,光滑,稍隆起,邊緣整齊或者波浪狀的綠色菌落,并有獨特的芳香氣味(圖1A)。革蘭氏染色鏡檢,為革蘭氏陰性小桿菌,單個散在或成對出現(xiàn)(圖1B),在SS瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基呈現(xiàn)典型性褐色菌落,菌落不規(guī)則,邊緣呈現(xiàn)傘狀伸展[2],在綠膿菌素培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色。2.2 分離菌的生化鑒定結(jié)果 分離菌生化試驗結(jié)果如表1所示。分離株氧化酶試驗、綠膿菌素試驗、明膠液化、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗和42℃生長試驗三者均為陽性,符合綠膿桿菌生化特性。

    圖1 分離株形態(tài)學觀察

    表1 分離株的生化試驗結(jié)果

    2.3 分離菌的分子生物學鑒定結(jié)果 經(jīng)過綠膿桿菌PCR檢測,該菌株在1051bp左右處產(chǎn)生目的條帶,確定為綠膿桿菌菌株(圖2)。

    圖2 綠膿桿菌PCR鑒定結(jié)果

    2.4 分離菌血清型的鑒定結(jié)果 分別取綠膿桿菌陽性血清G型、B型、C型一滴,滴于載玻片上,用接種環(huán)取營養(yǎng)瓊脂上菌落與血清混合,1min過后觀察可見C型血清呈現(xiàn)均勻的顆粒狀凝集,B型、G型血清未見凝集。

    2.5 分離菌的藥敏試驗結(jié)果 通過對抑菌圈的大小進行測量比對,結(jié)果表明該細菌對頭孢哌酮-舒巴坦、丁胺卡那霉素、慶大霉素高度敏感,對頭孢曲松、恩諾沙星、鏈霉素、多粘菌素B中度敏感,對阿莫西林、林可霉素、復方新諾明耐藥(表2)。

    表2 分離株的藥敏試驗結(jié)果(抑菌圈直徑) (mm)

    2.6 分離菌的毒力試驗結(jié)果 分離菌液體培養(yǎng)24h,細菌計數(shù)70億/ml,注射36h~48h試驗組小白鼠被毛凌亂,消瘦,死亡,對照組觀察7日正常。分離菌對小白鼠毒力較強。

    3 討論

    在臨床出血性肺炎的細菌分離中,綠膿桿菌以B型、G型居多[3],C型綠膿桿菌分離比較少,本試驗從患有出血性肺炎的病死水貂肺臟中分離致病菌,經(jīng)過細菌形態(tài)學觀察、生化實驗、PCR鑒定、血清凝集試驗,最終確定為致病性C型綠膿桿菌。

    不同地區(qū)分離的綠膿桿菌會因為血清型的不同或者當?shù)氐挠盟幥闆r不同而對抗生素的耐藥性產(chǎn)生差異,因此在養(yǎng)殖場不要單一長時間用藥,要根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇合適的藥物進行治療,或者輪換用藥。根據(jù)本試驗結(jié)果可以選擇左氧氟沙星全群拌料,慶大霉素、頭孢哌酮-舒巴坦或丁胺卡那霉素注射作為治療方案,經(jīng)過全場消毒、飼料熟制、藥物治療,第3天死亡下降,第5天停止死亡,第7天食欲全部恢復正常,達到了良好的治療效果。另外也可以選擇綠膿桿菌疫苗進行免疫,單一血清型綠膿桿菌疫苗保護性較差,應(yīng)采取多價菌株疫苗進行預防[4],有時候使用了疫苗還會發(fā)病,主要是因為血清型不同引起的,此外發(fā)生出血性肺炎除了綠膿桿菌的各個血清型之外還有克雷伯氏菌、巴氏桿菌、肺炎雙球菌等,一旦發(fā)生疾病還需要進行細菌分離和藥敏試驗,以確定疾病的類型和給予正確的治療治療方案,減少損失。

    近幾年來,我國水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較快,養(yǎng)殖數(shù)量及密度不斷提高,但是環(huán)境管理和疾病控制卻相對滯后。水貂在免疫力低下的情況下很容易感染一些條件致病菌,因此控制該類疾病除確定病原、接種疫苗、篩選敏感藥物外,還需要提高水貂養(yǎng)殖環(huán)境,注重飼料的合理搭配,提高水貂免疫力,從而控制原發(fā)疾病,形成科學規(guī)范的飼養(yǎng)管理,達到良好的經(jīng)濟效益。

    [1]陸承平.獸醫(yī)微生物學第5版[M].中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013, 152-153.

    [2]周庭銀.臨床微生物學診斷與圖解第2版[M].上??茖W技術(shù)出版社.2006, 197-200.

    [3]白雪等.水貂綠膿桿菌分離株的生物學特性和血清型分析[J].畜牧與獸醫(yī), 2011(7): 31-35.

    [4]柴秀麗等.水貂出血性肺炎的防治[J].特種經(jīng)濟動物, 2008(6): 13.

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