固定化溶菌酶的氧化石墨烯/聚醚砜雜化超濾膜制備及抗菌性能研究

朱軍勇，王瓊柯，許 欣，劉綽綽，劉金盾，張亞濤

（鄭州大學化工與能源學院，鄭州 450001）

固定化溶菌酶的氧化石墨烯/聚醚砜雜化超濾膜制備及抗菌性能研究

朱軍勇，王瓊柯，許 欣，劉綽綽，劉金盾，張亞濤

（鄭州大學化工與能源學院，鄭州 450001）

以氧化石墨烯（GO）為固定酶載體，在水溶液中通過靜電吸附及氫鍵作用實現(xiàn)溶菌酶(Ly)的固定化得到GO-Ly。并將已固定化酶的GO為添加劑，以聚醚砜為膜材料，采用相轉化法制備雜化超濾膜?？疾炝颂砑觿┖繉δば螒B(tài)、親水性、分離性能、力學性能及抗菌性能的影響。結果表明，GO-Ly的加入使雜化膜的親水性及純水通量得到明顯提高，同時拉伸強度也得到一定改善；尤其當GO-Ly添加量為1.5%（質量分數(shù)）時，膜的純水通量達到318 L/(m2?h)，并且對聚乙烯醇（PVA 30 000～70 000）的截留率維持在99%以上，對大腸桿菌的抑菌率可達68%。

氧化石墨烯；溶菌酶；聚醚砜超濾膜；抗菌性能

1 前言

超濾是近三十年來崛起的膜分離技術，廣泛應用于大分子組成與小分子物質的分離，包括水處理、化工、醫(yī)藥及食品等工業(yè)[1～3]。聚醚砜（PES）具有良好的熱力學、化學穩(wěn)定性以及力學性能，已經成為常用的商業(yè)超濾膜材料之一。但是PES由于自身疏水性的缺點，在應用中易受膜生物污染，進而導致原液滲透速率降低、通量下降等一系列問題，最終降低膜的效率和使用壽命，限制了PES作為商業(yè)膜的應用前景[4～6]。膜生物污染主要由于細菌粘附在膜表面進而生長繁殖并分泌產物，最終形成一層致密的生物膜。制備具有抗菌性能的膜，可阻止細菌等微生物在膜表面形成生物膜并殺死細菌，在一定程度上抑制膜生物污染[7，8]。制備抗菌超濾膜主要通過膜表面改性和共混改性。其中，共混改性簡單易行，在保證膜機械性能和化學穩(wěn)定性的基礎上，以抗菌材料作為添加組分制備共混膜，賦予膜一定的抗菌性能，能夠減緩膜生物污染[9～12]。因此，膜共混改性有效擴大了超濾膜的適用范圍，是制備抗菌超濾膜的有效方法之一。酶是具有生物催化功能的生物大分子，具有催化高效性、選擇性強、反應條件溫和等特性，相對其他多數(shù)抗菌劑，酶可以被微生物分解，且產物大多無毒，符合綠色化學的要求。其中，溶菌酶抗菌譜較廣，對革蘭氏陽性菌如枯草菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有較好的抗菌效果。溶菌酶安全性很高，特異性強，在食品、生物工程以及畜牧業(yè)中應用廣泛[12～15]。氧化石墨烯（GO）是石墨烯氧化物的片層結構，含有大量易改性含氧官能團[16，17]。GO可以通過GO片層與其他分子之間的π-π堆積力、范德華力以及氫鍵等非共價鍵進行結合[18]。本文以GO作為固定溶菌酶的載體材料，通過靜電作用將溶菌酶固定在GO表面，并以PES作為膜材料，通過共混改性的方法制備抗菌超濾膜。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

天然石墨粉（粒徑約為45 μm），青島興和石墨有限公司；PES，工業(yè)品，BASF公司；異硫氰酸熒光素(FITC)，95%，溶菌酶，生化試劑，百靈威化學試劑有限公司；聚乙二醇（PEG 20 000），分析純，上?；瘜W試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮（PVP），N，N-二甲基乙酰胺（DMAc），分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；聚乙烯醇（PVA 30 000～70 000），分析純，ACROSORGANICS，美國。其他試劑均為分析純。

美國FEI公司TECNAI G2型透射電子顯微鏡（TEM）；杭州賽菲膜分離技術有限公司SF-SB型膜性能評價儀，測試條件為0.2 MPa；日本島津公司UV-2450型紫外-可見分光光度計（UV-Vis）；日本JEOL公司JSM-6700F型掃描電子顯微鏡（SEM），測試電壓為25 kV；接觸角測定儀(OCA20)，德國Dataphysics公司；萬能材料試驗機，AG-10-TB，日本津島公司；落射熒光顯微鏡（BM-21AY），上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。

2.2 GO的制備

取4.5 g石墨粉末加入燒瓶中，添加體積比為9∶1的濃H2SO4/H3PO4混合液，在磁力攪拌條件下緩慢加入25 g高錳酸鉀，油浴溫度50℃下攪拌24 h。反應結束后自然冷卻，加入1 000 mL碎冰，攪拌中加入30%H2O2直至混合物變?yōu)榻瘘S色，超聲2～3 h。通過超聲降解法將其剝離成GO片層；將剝離后的混合液低速離心去沉淀，再高速離心。下層沉淀用30%鹽酸洗滌并磁力攪拌12 h，離心并用無水甲醇離心洗滌3遍，真空干燥24 h。

2.3 GO固定溶菌酶

GO表面含有大量含氧官能團，當4

具體實驗步驟如下：取50 mg上文制備的GO加入100 mL磷酸鹽緩沖液中（0.2 mol/L、pH=6.2），室溫條件下超聲分散30 min；取180 mg溶菌酶加入上述緩沖液中，在4℃冰水浴中磁力攪拌1 h；反應結束后，離心，收集上清液測定酶固定量；將沉淀用同種緩沖液多次洗滌以除去物理吸附的溶菌酶，將最終產物真空冷凍干燥后置于4℃環(huán)境中保存，即獲得固定化溶菌酶（GO-Ly）。

2.4 抗菌超濾膜的制備

如圖1所示，將一定量的GO-Ly超聲分散于DMAc中，隨后將一定量的PES、丙酮、PVP加入到DMAc溶劑中，在室溫下機械攪拌至少15 h，制備出透明的均相鑄膜液；過濾，真空脫泡；然后在干凈的玻璃板上用刮刀刮出厚度約為0.1 mm的初生態(tài)膜，隨后放入40℃去離子水中相轉化成膜。

配制鑄膜液（100 g）的組分及含量分別為：PES 18 g，PVP 8 g（致孔劑），DMAc 73.2 g以及丙酮0.8 g。鑄膜液中GO-Ly的添加量為PES質量的0%、0.5%、1.0%、1.5%。以GO-Ly添加量為0%時制備的超濾膜作為空白對照組。

圖1 抗菌超濾膜制備過程示意圖Fig.1 The process scheme of preparation of antibacterial ultrafiltration membrane

2.5 膜的分離性能、機械性能和抗菌性能表征

評價PES超濾膜分離性能的重要指標是純水通量和截留率。本文采用膜性能評價儀測定超濾膜的純水通量J和對兩種溶質（PEG 20 000和PVA 30 000～70 000，初始濃度均為0.5 g/L）的截留率R。用UV-Vis測量透過液的濃度。純水通量J和截留率R通過式（1）和式（2）計算。

式（1）中，J為純水通量，L/(m2?h)；A為有效膜面積，m2，本文中A為0.222 3 m2；Δt為透過時間，h；V為Δt時間內通過膜的透過液的體積，L。

式（2）中，R為截留率，%；Cp為透過液的濃度，mg/L；Cf為原料液中的濃度，mg/L；Cp和Cf的值均由UVVis測得。

為判定抗菌劑的加入對超濾膜彈性拉伸力和斷裂伸長率的影響，本文采用AG-10-TB萬能材料試驗機測試超濾膜。測定前，將樣品膜裁剪成50 mm×25 mm（長×寬）大小，對樣品條以拉伸速度10 mm/min進行拉伸測試。每個樣品膜測定3次，實驗結果取平均值。

實驗中選擇大腸桿菌（E.coli）為實驗對象。實驗用到的儀器均經滅菌處理，并在無菌操作臺完成實驗。制備106數(shù)量級的大腸桿菌菌液備用。將各種膜剪碎后稱取0.06 g于試管中（用空白膜作為對照），每個試管中加入5 mL 106數(shù)量級的大腸桿菌菌液，置于37℃、250 r/min的搖床中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)后取出試管搖勻，吸取0.5 mL菌液于4.5 mL的無菌水中稀釋，該試管中的菌濃度為培養(yǎng)后濃度的10-1，并按此稀釋，得到的稀釋濃度依次是10-2、10-3、10-4和10-5。取10-5濃度的稀釋液0.1 mL于平板上，涂布均勻（此步驟做兩個平行實驗）。將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后觀察結果，采集圖像并對菌落計數(shù)，按式（3）計算抑菌率（BR）

式（3）中，A為對照組最終培養(yǎng)出的菌落數(shù)，cfu；B為實驗組最終培養(yǎng)出的菌落數(shù)，cfu。

3 結果與討論

3.1 GO及GO-Ly的表征

圖2a為GO的TEM圖像，從圖中可以看出，所制備的GO為納米片層結構，并且呈現(xiàn)帶有褶皺的薄紗形貌，表現(xiàn)出了GO的典型特征。為進一步觀察固定溶菌酶后的GO形貌變化，本研究對GO-Ly做了TEM分析，如圖2b所示，GO片層堆積，不再是良好的單層納米片薄紗狀結構，褶皺更加明顯，表明溶菌酶成功固定在GO表層。

圖2 GO和GO-Ly的TEM圖Fig.2 TEM images of GO and GO-Ly

3.2 GO-Ly熒光分析

本文利用具有熒光特性的FITC標記溶菌酶，觀察標記后的溶菌酶（FITC-溶菌酶）固定于GO的熒光圖片，結果如圖3所示。圖3所示為以靜電吸附方式得到的GO-Ly。在激發(fā)波長為490 nm條件下，熒光顯微鏡中可觀察到明亮的黃綠色熒光。圖3中明顯充滿明亮的熒光，這表明溶菌酶通過靜電吸附能成功固定到GO表面。

3.3 抗菌超濾膜的性能研究

3.3.1 膜上表面及斷面形貌

為研究GO-Ly的添加對膜形態(tài)的影響，圖4a為超濾膜上表面的SEM圖像，可以看出空白膜表面粗糙平整。圖4b為雜化膜的上表面，可以看出，與GO-Ly共混后的雜化膜表面更加平整，粗糙程度降低，這從另一個角度說明了雜化膜的親水性高于空白膜，這一結果與親水性能測試結果一致。圖4c和圖4d分別為空白膜和雜化膜的斷面形貌，由圖可知GO-Ly的加入并未改變膜的指狀孔結構，但雜化膜的致密皮層厚度變厚，這可能是由于GO-Ly的加入增加了鑄膜液的黏度，延長了相分離時間所導致的。另外，雜化膜皮層較空白膜稀疏，膜孔密度增大；指狀孔壁是較稀疏的海綿結構，指狀孔增多，孔徑增大，上下貫通性良好。

3.3.2 膜的親水性能

圖4 空白膜和雜化膜的上表面與斷面的SEM圖像Fig.4 SEM images of supine surface and cross-section of bare membrane and hybrid membrane

通過比較空白膜與雜化膜的接觸角，研究不同GO-Ly添加量對雜化超濾膜表面親水性能的影響，如圖5所示。從圖5中可以看出，不含GO-Ly的PES膜具有較大的接觸角（82o），顯示出較高的疏水性能。隨著GO-Ly添加量的增加，膜的接觸角持續(xù)降低，當添加量為1.5%（質量分數(shù)）時，接觸角低至66°，說明雜化膜親水性隨著GO-Ly添加量的增加不斷升高。這主要是由于GO富含大量親水性基團，另外GO的比表面積相當大（2 600 m2/g），溶菌酶分子在其表面的結合位點由GO邊緣大量的羧基以及基面上隨意分布的羥基和環(huán)氧基提供。GO固定溶菌酶后仍然有相當大的面積暴露在外，具有親水性。在相轉化過程中，隨著鑄膜液中GO-Ly含量增加，具有親水性能的GO-Ly向膜表面移動以減少表面能，從而提高了共混膜表面的親水性。

3.3.3 分離性能

圖5 添加劑GO-Ly含量對膜接觸角的影響Fig.5 The effect of GO-Ly content on contact angle of hybrid membrane

圖6顯示了不同含量的GO-Ly對雜化膜分離性能的影響。由圖6可知，在0.1 MPa下，不含GO-Ly的空白膜的純水通量僅為198.5 L/(m2?h)。隨著GO-Ly含量的增加，雜化膜的純水通量顯著提高，當含量僅為1.5%（質量分數(shù)）時，雜化膜的純水通量增至318 L/(m2?h)，與空白膜相比，通量提高了60.2%。另外，隨著GO-Ly含量的增加，純水通量增加的趨勢變緩，開始階段主要由于添加劑的親水性使得純水通量明顯增加，但是隨著含量的增加，一方面由于GO-Ly本身疏水，另一方面由于含量增加導致團聚概率大大增加，而GO片層不能透水，使得膜的有效透過面積降低，進而影響了雜化膜的透過性能。圖6也顯示了當GO-Ly含量分別為0.5%、1.0%和1.5%（質量分數(shù)）時雜化膜對PEG 20 000和PVA 30 000～70 000截留率的變化。隨著GO-Ly含量的增加，雜化膜對PEG 20 000的截留率降低，介于73%～87%，而對PVA 30 000～70 000具有良好的截留效果。這可能是由于GO-Ly發(fā)生局部團聚，加入到鑄膜液中后，可能造成雜化膜的孔徑增大，孔密度增加，表現(xiàn)為純水通量增大，對PEG 20 000的截留率下降。

圖6 不同含量GO-Ly對雜化膜的純水通量及截留率的影響Fig.6 The effect of GO-Ly content on water flux and rejection of hybrid membrane

3.3.4 膜的力學性能

通過測定雜化膜的拉伸強度和斷裂伸長率考察GO-Ly添加量對膜的機械性能的影響，其拉伸應力-應變曲線如圖7所示。雜化膜的機械性能主要受到添加劑分子交聯(lián)和膜的均相性兩方面因素的影響。由圖7可知，當GO-Ly含量增加時，雜化膜的拉伸強度基本呈增加趨勢，但斷裂伸長率則出現(xiàn)不規(guī)律變化，可能是由于GO-Ly粒徑較大，在膜主體中分散不均勻使膜均相性下降所造成的。

3.3.5 抗菌性能

本文通過引入具有抗菌性能的GO-Ly制備抗菌雜化膜，GO-Ly的作用是增加膜的抗菌性能。為了考察雜化超濾膜的抗菌性能，選擇大腸桿菌做膜的抗菌實驗?？咕Ч鐖D8所示。隨著GO-Ly含量的增加，雜化膜的抗菌性能升高。由圖8可知，相對空白膜培養(yǎng)皿中大腸桿菌的數(shù)量，雜化膜培養(yǎng)皿中大腸桿菌的數(shù)量明顯減少，說明GO-Ly對大腸桿菌有一定抑制作用，同時也證明了GO-Ly已經被引入膜材料中。相對于空白膜，雜化膜對大腸桿菌的抑菌率為68%。

圖7 不同含量的GO-Ly對雜化膜力學性能的影響Fig.7 The effect of GO-Ly content on mechanical property of hybrid membrane

圖8 空白膜及含1.5%GO-Ly雜化膜對大腸桿菌的抗菌效果Fig.8 Antibacterial effect of PES membrane and hybrid membrane with 1.5%of GO-Ly against E.coli

在常溫條件下，雜化膜保存2個月后仍然具有良好的抗菌活性，說明GO-Ly雜化超濾膜具有一定的抗菌持久性。

4 結語

以GO為固定溶菌酶的載體材料，主要通過靜電吸附方式使溶菌酶固定在GO表面，并通過GOLy與PES共混制備GO-Ly/PES雜化膜。通過對雜化膜進行一系列表征得到以下結論：GO-Ly的加入能較大程度地改善雜化膜的親水性；另外，隨著GOLy含量的增加，雜化膜的純水通量顯著增大，雖然對PEG 20 000的截留率降低，但是對PVA 30 000～70 000的截留率仍維持在99%以上，同時對大腸桿菌的抑菌率可達68%，并表現(xiàn)出了一定的抗菌持久性。

[1]Susanto Heru，Ulbricht Mathias.Characteristics，performance and stability of polyethersulfone ultrafiltration membranes prepared by phase separation method using different macromolecular additives[J].Journal of Membrane Science，2009，327(1/2)：125-135.

[2]Puro L，Kallioinen M，M?ntt?ri M，et al.Performance of RC and PES ultrafiltration membranes in filtration of pulp mill process waters[J].Desalination，2010，264(3)：249-255.

[3]Su Yanlei，Li Chao，Zhao Wei，et al.Modification of polyethersulfone ultrafiltration membranes with phosphorylcholine copolymer can remarkably improve the antifouling and permeation properties[J].Journal of Membrane Science，2008，322(1)：171-177.

[4]Shi Qing，Su Yanlei，Zhu Shiping，et al.A facile method for synthesis of pegylated polyethersulfone and its application in fabrication of antifouling ultrafiltration membrane[J].Journal of Membrane Science，2007，303(1/2)：204-212.

[5]Yu Haoxia，Zhang Yatao，Zhang Jingyi，et al.Preparation and antibacterial property of SiO2-Ag/PES hybrid ultrafiltration membranes[J].Desalination and Water Treatment，2013，51(16-18)：3584-3590.

[6]Chen Yifeng，Zhang Yatao，Liu Jindun，et al.Preparation and antibacterial property of polyethersulfone ultrafiltration hybrid membrane containing halloysite nanotubes loaded with copper ions[J].Chemical Engineering Journal，2012，210：298-308.

[7]Ciston Shannon，Lueptow Richard M，Gray Kimberly A.Bacterial attachment on reactive ceramic ultrafiltration membranes[J].Journal of Membrane Science，2008，320(1/2)：101-107.

[8]Zhu Xiaoying，Bai Renbi，Wee Kin-Ho，et al.Membrane surfaces immobilized with ionic or reduced silver and their anti-biofouling performances[J].Journal of Membrane Science，2010，363(1/2)：278-286.

[9]Chen Yifeng，Zhang Yatao，Zhang Haoqin，et al.Biofouling control of halloysite nanotubes-decorated polyethersulfone ultrafiltration membrane modified with chitosan-silver nanoparticles[J].Chemical Engineering Journal，2013，228：12-20.

[10]Yu Haoxia，Zhang Xiaofei，Zhang Yatao，et al.Development of a hydrophilic PES ultrafiltration membrane containing SiO2@N-Halamine nanoparticles with both organic antifouling and antibacterial properties[J].Desalination，2013，326：69-76.

[11]Zhang Jingyi，Zhang Yatao，Chen Yifeng，et al.Preparation and characterization of novel polyethersulfone hybrid ultrafiltration membranes bending with modified halloysite nanotubes loaded with silver nanoparticles[J].Industrial&Engineering Chemistry Research，2012，51：3081-3090.

[12]Yu Liang，Zhang Yatao，Zhang Bing，et al.Preparation and characterization of HPEI-GO/PES ultrafiltration membrane with antifouling and antibacterial properties[J].Journal of Membrane Science，2013，447：452-462.

[13]Li W，Li X，Wang Q，et al.Antibacterial activity of nanofibrous mats coated with lysozyme-layered silicate composites via electrospraying[J].Carbohydrate Polymers，2014，99：218-225.

[14]Eby D Matthew，Schaeublin Nicole M，F(xiàn)arrington Karen E，et al.Lysozyme catalyzes the formation of antimicrobial silver nanoparticles[J].ACS Nano，2009，3(4)：984-994.

[15]Wang Qiang，F(xiàn)an Xuerong，Hu Yingjun，et al.Antibacterial functionalization of wool fabric via immobilizing lysozymes[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2009，32(5)：633-639.

[16]Edwards J Vincent，Prevost Nicolette T，Condon Brian，et al.Covalent attachment of lysozyme to cotton/cellulose materials：Protein verses solid support activation[J].Cellulose，2011，18(5)：1239-1249.

[17]Paredes J I，Villar-Rodil S，Martinez-Alonso A，et al.Graphene oxide dispersions in organic solvents[J].Langmuir，2008，24(19)：10560-10564.

[18]Wang Shiren，Zhang Yue，Abidi Noureddine，et al.Wettability and surface free energy of graphene films[J].Langmuir，2009，25(18)：11078-11081.

Preparation and antibacterial property of polyethersulfone hybrid ultrafiltration membrane containing GO immobilized by lysozyme

Zhu Junyong，Wang Qiongke，Xu Xin，Liu Chuochuo，Liu Jindun，Zhang Yatao
(School of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

Graphene oxide(GO)provides an ideal substrate for lysozyme immobilization due to a large specific surface area and abundant functional groups.The lysozyme immobilization on the GO sheets could take place readily by electrostatic interaction of GO-lysozyme(GO-Ly).The immobilized lysozyme of GO used as the addictive was blended with polyethersulfone(PES)to prepare hybrid ultrafiltration membrane via phase inversion.The effect of GO-Ly content on the morphology，hydrophilicity，separation，mechanical and antibacterial properties of hybrid membranes was investigated.The results showed that the surface hydrophilicity and water flux were significantly improved with the increase of GO-Ly content.Meanwhile，the mechanical strength of hybrid membrane was also increased.Especially when GO-Ly content was 1.5%，the water flux reached up to 318 L/(m2?h).The rejection of polyvinyl alcohol(PVA 30 000～70 000)was 99%and the antibacterial rate of the hybrid membrane against E.coli could achieve 68%.

graphene oxide；lysozyme；polyethersulfone ultrafiltration membrane；antibacterial property

O631；TQ028.8

A

1009-1742(2014)07-0023-07

2014-05-08

國家自然科學基金項目（21106137，21376225）；中國博士后基金項目（2013M531684）；大學生創(chuàng)新實驗訓練計劃項目（2013xjxm075，2013xjxm072）

張亞濤，1980年出生，男，河南項城市人，教授，主要從事抗菌超濾膜及CO2促進傳遞膜研究；E-mail：zhangyatao@zzu.edu.cn