小反芻獸疫病原學(xué)及疫苗研究進展

卯嶺+張靖+潘慶慶

摘要：小反芻獸疫（PPR）是一種急性病毒性傳染病，2013年12月份以來，我國多個?。▍^(qū)）相繼發(fā)生小反芻獸疫疫情，嚴重影響了養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和羊肉產(chǎn)品有效供給，充分認識小反芻獸疫研究進展具有十分重要的意義。文章綜述了小反芻獸疫病原學(xué)和疫苗的研究進展，為小反芻獸疫防控機理提供參考。

關(guān)鍵詞：小反芻獸疫；病毒；疫苗

中圖分類號：S851.2 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）07-0063-02

收稿日期：2014-06-14

作者簡介：卯 嶺（1988-），男，貴州威寧人，助理獸醫(yī)師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

小反芻獸疫（Pestedes petits ruminants，PPR） 俗稱羊瘟，是由小反當獸疫病毒Pestedes petits ruminantsvirus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征[1]。羊高度易感，牛、豬等動物也可以感染帶毒，野生動物偶有發(fā)生。該病具有高發(fā)病率和死亡率，對畜牧業(yè)構(gòu)成嚴重的威脅。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類傳染病，在我國列為一類動物疫病。

1 病原學(xué)研究

1.1 病毒的生物學(xué)特性

小反芻獸疫病毒（PPRV）屬于副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬，該病毒屬于囊膜病毒，病毒顆粒外被厚約8.5～14.5 nm的囊膜，囊膜上有兩種纖突糖蛋白。病毒核衣殼由核蛋白（N）和磷蛋白（P）組成，呈螺旋對稱，螺旋直徑約為18 nm，螺距為5～6 nm，總長度約為1 000 nm。另外還有囊膜基質(zhì)蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）和H蛋白[2]。PPRV可以在MDBK、BHK21、Vero細胞上繁殖，同時也可以在山羊或綿羊的胎腎、人羊膜、犢牛腎和猴腎的原代或傳代細胞上生長繁殖，并且會出現(xiàn)細胞病變（CPE），一般會在接種細胞后1～2周才會看到病變。

1.2 病毒分子生物學(xué)特性

PPRV的基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA， 分別編碼 6 種結(jié)構(gòu)蛋白和 2 種非結(jié)構(gòu)蛋白，依次是核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（HN）、大蛋白（L）和 C、V 非結(jié)構(gòu)蛋白。

N 蛋白由 N 基因含有的惟一1個開放閱讀框編碼的 525 個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量大小約為 57.7 kU，在病毒中含量最高，是核衣殼的主要組成蛋白。N蛋白有4個主要的區(qū)域：氨基末段和蛋白中部I、Ⅲ的保守區(qū)以及易變異的Ⅱ區(qū)、Ⅳ區(qū)（C端）。N蛋白的主要作用是保護病毒RNA免受核糖核酸酶I的破壞，與RNA結(jié)合作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板，被認為在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要的作用[3]。

P 基因含有 3 個開放閱讀框，編碼的蛋白分子質(zhì)量約為 54.9 kU，含有 509 個氨基酸， 它能與 N 和 L 蛋白連接，作為分子伴侶使 N 蛋白保持可溶狀態(tài)與 RNA 相連，同時是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的輔助因子。由于 P 蛋白屬于酸性蛋白并且具有較多的蘇氨酸和絲氨酸，能為轉(zhuǎn)錄后磷酸化提供較多的潛在位點，而這種磷酸化作用能增加整個分子的負電荷和分子大小，因此會造成 P 蛋白在聚丙烯凝膠電泳中的異常遷移。

M 蛋白位于病毒囊膜的內(nèi)側(cè)，序列具有高度的保守性，分子質(zhì)量約為 38 kU。M 蛋白在成熟病毒粒子從細胞內(nèi)釋放的過程中起著關(guān)鍵性的作用，病毒缺失 M蛋白后就失去了感染細胞的能力。有研究表明 M 蛋白是以蛋白中部的 C 端和病毒囊膜相結(jié)合的.

F 蛋白又稱融合蛋白，是病毒表面的一種糖蛋白，屬于一型糖蛋白，含有 546個氨基酸，分子質(zhì)量約為 59.31 Ku。F 蛋白能夠誘導(dǎo)細胞病變，導(dǎo)致細胞產(chǎn)生溶血素、細胞融合和啟動病毒感染，決定病毒感染的成功與否。

H 蛋白又稱吸附蛋白，是 PPRV 表面的另一種糖蛋白，由 609 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為 70 Ku，是最不保守的蛋白。H 蛋白具有血凝素，含有 T 細胞決定簇，與宿主細胞的特異性有關(guān)。

L 蛋白主要是通過 P 蛋白與病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制模板復(fù)合體 N-RNA 相互作用，從而構(gòu)成核蛋白復(fù)合體，用來形成病毒的mRNA。

C 和 V的形成是由于 P 基因的閱讀框經(jīng)移碼后造成的非結(jié)構(gòu)蛋白。C 蛋白是最小的蛋白，V 蛋白可在干擾素通路和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。

1.3 病毒致病機理

該病毒先通過口、咽上呼吸道上皮或扁桃體進入體內(nèi)，在局部淋巴結(jié)增殖，減弱淋巴細胞的免疫力，進而擴散到淋巴組織中，之后經(jīng)血液循環(huán)到達全身各處淋巴結(jié)、腸黏膜、呼吸道黏膜 ，導(dǎo)致淋巴組織壞死，免疫功能下降，最終引起繼發(fā)感染和支氣管肺炎。病毒粒子在 H 和 F 蛋白的協(xié)助下將核衣殼注入靶細胞，最終使病毒粒子與靶細胞融合。在病毒復(fù)制過程中需要多種聚合酶和復(fù)制酶，這些復(fù)制酶對病毒自身的 L 蛋白或其他多種新的蛋白有依賴作用，同時病毒的復(fù)制過程還包括 mRNA翻譯病毒多肽或蛋白的過程[4]。

2 小反當獸疫疫苗研究進展

目前該病尚無有效治療方法，發(fā)現(xiàn)病例應(yīng)嚴密封鎖疫區(qū)，撲殺患畜，隔離消毒。對PPR的控制主要依靠疫苗，現(xiàn)有疫苗及免疫方法很多，效果差異也很大。

2.1 牛瘟弱毒疫苗

由于 PPRV 和牛瘟病毒（RPV） 之間的抗原相關(guān)性很強[5]，可用牛瘟 （RP） 組織培養(yǎng)的弱毒疫苗對綿羊、山羊進行免疫，產(chǎn)生的抗 RP 抗體能夠很好的抵抗 PPR 野毒株的攻擊，但是這種方法不利于全球牛瘟消滅計劃的實施。其主要缺點是：免疫動物僅產(chǎn)生抗 RPV 的中和抗體，而沒有抗 PPRV 的中和抗體。RPV和 PPRV H 基因序列分析表明，兩種病毒 H 蛋白氨基酸的同源性不足 60%，而相對比較保守的 F 蛋白同源性為 80%。因此，RPV 弱毒疫苗抗 PPR 的保護作用，可能由 F 蛋白提供，而該蛋白主要誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。此外，RPV 弱毒疫苗免疫動物，用 PPRV 攻擊感染后，抗 PPRV 中和抗體呈升高態(tài)勢。這表明 PPRV 在免疫動物體內(nèi)有短暫的復(fù)制過程，存在散毒可能性。

2.2 PPRV 弱毒疫苗

通過 Vero 細胞的連續(xù)傳代，成功研制了 Nigeria 75/1 PPR弱毒疫苗，該苗無任何副作用。由于 PPRV 對熱高度敏感，致使 Nigeria 75/1 疫苗的穩(wěn)定性很差，不利于基層的運輸和使用。

2.3 PPR 滅活疫苗

用感染山羊的病理組織可制備同源的PPR滅活疫苗。但是，甲醛滅活的疫苗效果不佳，而用氯仿滅活制備的疫苗免疫山羊后血清抗體可以持續(xù)8個月。

2.4 重組亞單位疫苗

利用疹病毒屬的表面糖蛋白具有良好的免疫原性，重組桿狀病毒表達的 HN 蛋白能刺激機體產(chǎn)生體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體能中和 PPRV 和 RPV。國外學(xué)者在大腸桿菌中分別過表達了 PPRV 和 RPV的 N 蛋白，在無病毒 RNA 存在的情況下，能裝配成類似于病毒的核衣殼。純化的重組病毒核衣殼單劑量、無佐劑時即可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強的抗原特異性 CTL免疫應(yīng)答，而且 PPRV 和 RPV 間可交叉反應(yīng)。

2.5 嵌合體疫苗

應(yīng)用反向遺傳技術(shù)制備RP/PPRV嵌合體疫苗，即用PPRV的糖蛋白基因替代RPV疫苗表面相應(yīng)的糖蛋白基因。這種疫苗不僅對PPRV具有良好的免疫原性，而且免疫動物血清中無特異的RP病毒ELISA抗體。

2.6 活載體疫苗

國外學(xué)者將 PPRV 的 F 基因插入羊痘病毒的 TK 基因編碼區(qū)，構(gòu)建了重組羊痘病毒疫苗 recCapPPR/F，該重組病毒可抵抗 PPRV 強毒的攻擊感染，同時也能預(yù)防羊痘病毒的感染。重組羊痘活載體疫苗應(yīng)是小反芻獸疫疫苗新的發(fā)展方向。

2.7 RNA 干涉技術(shù)

通過合成的小干擾 RNA（siRNA）作用于 N 蛋白基因的兩個區(qū)，導(dǎo)致病毒復(fù)制減少了 80%以上，通過實時定量 PCR 檢測病毒 RNA、流式細胞儀測定病毒蛋白的產(chǎn)生、CPE 評價病毒粒子的產(chǎn)生和測定病毒滴度評價 siRNA 對PPRV 復(fù)制的影響，證明 siRNA 分子有發(fā)展為 PPRV 和 RPV 治療劑的潛力[5]。

3 小結(jié)

PPRV 主要感染山羊和綿羊等小反芻獸，但是不同品種的羊敏感性有顯著差別。山羊比綿羊更易感，幼齡動物易感性較高，哺乳期的動物抵抗力較強。另外，豬和牛也可以感染 PPRV，但通常無臨床癥狀，也不能夠?qū)⑵鋫魅窘o其他動物。一直以來小反芻獸疫的防治問題都沒有得到很好地解決，目前，我國的羊群的疫情監(jiān)測及防治技術(shù)與發(fā)達國家相比還有很大的差距，很多疫苗和標準化試劑盒還是沿用國外產(chǎn)品，因此要求加強對PPR免疫機理和PPR疫苗的研究工作，加強PPR的防治與疫情監(jiān)測技術(shù)的研究工作，開發(fā)出安全、有效、實用的疫苗及建立快速標準化檢測手段顯得十分重要。

參考文獻：

[1] 印春生，支海兵.小反芻獸疫研究進展[J].中國獸藥雜志，2007，41（8）：22.

[2] 劉玉洪，徐自忠，花群義，等.小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2006，27（12）： 1-6.

[3] 井 波，趙玉軍，袁 遠.小反當獸疫病毒研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，36（6）： 40-43.

[4] 李井春，趙鳳菊，趙玉軍.小反芻獸疫[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（12）：63-64.

[5] SERVAN DE ALMEIDAl R，KEITA D，Libeau G，et al.Control of ruminant morbilli- virus replication by small interfering RNA[J].General Virology，2007，88（8）：2307-2311.