部分野生杜鵑雜交授粉后花粉管生長狀況分析

耿興敏，張超儀，尹增芳

(1.南京林業(yè)大學(xué) 風景園林系，江蘇南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

我國野生杜鵑花資源豐富，占世界杜鵑花資源的半數(shù)以上［1］，但我國對于杜鵑花資源的應(yīng)用與研究，尤其是新品種選育方面，還相當薄弱，僅限于張長芹［2］、劉曉青［3］等的報道.國外有關(guān)杜鵑花雜交育種的研究起步較早，雜交育種相關(guān)的研究也有大量報道，到2002年為止，登記的杜鵑花新品種已經(jīng)有28 000種［4］.杜鵑花種間雜交障礙存在著受精前與受精后障礙.杜鵑種間雜交授粉后，花粉基本在柱頭都可以萌發(fā)，但柱頭表面可能會產(chǎn)生胼胝質(zhì)阻止花粉管進入花柱，在進入花柱后，花粉管也可能發(fā)生頂端膨大、變形、停止生長等現(xiàn)象，或花粉管無法進入胚珠以及花粉管在胚囊過度生長等［5－7］.花粉管的生長受阻可能發(fā)生在不同的部分，不同雜交組合中花粉管生長受阻的部位存在種間差異［6］.有報道稱蒙導(dǎo)授粉和正己烷處理可以克服杜鵑受精前障礙［8］.受精后障礙主要表現(xiàn)為胚珠停止發(fā)育，種子不萌發(fā)或萌發(fā)率很低以及后代出現(xiàn)白化苗等現(xiàn)象［9－11］.胚拯救是克服受精后障礙的有效技術(shù)手段，在杜鵑育種中也有報道［12］.在常綠杜鵑與黃花落葉杜鵑雜交過程中，常出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象，Ureshino等［13－14］利用三重雜交、回交和倍性雜交等有效克服了受精后障礙并獲得綠色幼苗.

近年來，各地紛紛展開了野生杜鵑的引種馴化工作，但由于野生杜鵑大多分布在高山地區(qū)，生長發(fā)育要求冷涼的環(huán)境條件，對高溫的忍耐力不強，杜鵑屬植物，尤其是常綠品種的引種栽培至今沒有成功［15－16］.高溫脅迫嚴重影響了杜鵑花在我國城市中的推廣應(yīng)用.

因此該研究以培育耐熱性強、生態(tài)適宜范圍廣的杜鵑新品種為目的，以南京地區(qū)栽培的耐熱性較好的映山紅(Rhododendron simsii)和錦繡杜鵑(Rhododendron pulchrum)為母本，自交的同時，與高海拔地區(qū)引種的杜鵑屬其他各種進行雜交.利用熒光顯微鏡觀察這些雜交組合授粉后花粉管的生長狀況，分析其遠緣雜交親和性的同時，進一步明確杜鵑雜交存在的種間雜交受精前、后障礙，為我國野生杜鵑的雜交育種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以南京地區(qū)栽培的映山紅(R.simsii)、錦繡杜鵑(R.pulchrum)為母本，自交的同時，以表1所列野生杜鵑種為父本(花粉來自中科院昆明植物園)，配置雜交組合.

表1 各杜鵑野生種的學(xué)名、分類及編號Tab.1 Latin name and classification of wild Rhododendron and their abbreviations

1.2 試驗方法

2011年4月中旬開花前3 d對母本進行去雄套袋，待柱頭分泌大量黏液時選擇于當天上午9:00—12:00進行常規(guī)人工授粉，各組合至少重復(fù)15朵花.授粉24、48、72 h后采集花柱及子房，每個雜交組合取5朵花.參照Ureshino等［5］的方法，將柱頭等用FAA液固定24 h后，置于70%的酒精內(nèi)，于4℃條件下保存，用于解離、染色和觀察.用3 mol·L－1的NaOH溶液45℃水浴解離3 h，解離前后都要用蒸餾水沖洗，然后用0.1%的苯胺藍(0.1 mol·L－1K3PO4·7H2O緩沖液)染色3 h，壓片后使用Leica DM500B熒光顯微鏡觀察、拍照.統(tǒng)計花粉管生長數(shù)量及其異?；ǚ酃艿谋嚷?

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交組合花粉管異常生長狀況分析

雜交授粉后花粉管生長狀況如圖1所示.圖1中:(1)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭萌發(fā)，并向下開始生長(箭頭所示);(2)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭上部生長，部分花粉管出現(xiàn)膨大、扭曲生長(箭頭所示);(3)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭下部生長，胼胝質(zhì)規(guī)則分布(箭頭所示);(4)映山紅×白花杜鵑，雜交授粉3 d后花粉管進入胚囊;(5)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑，授粉5 d后，大多花粉管在柱頭纏繞(箭頭所示)，沒有進入花柱道，花粉管有胼胝質(zhì)不規(guī)則沉積(箭頭所示);(6)映山紅×薄皮杜鵑，花粉管粗細不均(箭頭所示);(7)錦繡杜鵑×滇南杜鵑，花粉管在柱頭表面打結(jié)(箭頭所示);(8)映山紅×滇南杜鵑，花粉管在花柱內(nèi)螺旋、打結(jié)(箭頭所示);(9)映山紅×露珠杜鵑，花粉管破裂(箭頭所示);(10)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑，花粉管螺旋生長、粗細不均(箭頭所示);(11)錦繡杜鵑×紅露珠杜鵑，先端沉積胼胝質(zhì)塞(箭頭所示);(12)錦繡杜鵑×睫毛杜鵑，花粉管卷曲、雜亂生長(箭頭所示);(13)錦繡杜鵑×露珠杜鵑，花粉管尖端膨大成氣球狀(箭頭所示);(14)映山紅×滇南杜鵑，雜交后子房未見膨大，但雜交24 h后花粉管就進入胚囊(箭頭所示);(15)映山紅×美容杜鵑，花粉管在子房內(nèi)螺旋生長(箭頭所示);(16)映山紅×映山紅(昆明)，花粉管正常生長.

總之，該試驗所配置的雜交組合中，所有花粉在授粉1 d后都能在柱頭萌發(fā)，雜交親和的花粉在花柱上部花粉管也部分出現(xiàn)異常，但大多數(shù)花粉仍能繼續(xù)生長進入胚囊(圖1(1)～1(4)).雜交親和性較差的組合，如圖1(5)所示，錦繡杜鵑×薄皮杜鵑在授粉5 d后大多數(shù)花粉還在柱頭盤旋，沒有進入花柱.所有雜交組合花粉管生長狀況的觀察結(jié)果表明，花粉管異?，F(xiàn)象主要表現(xiàn)為花粉管粗細不均、螺旋、破損、尖端膨大、雜亂生長、胼胝質(zhì)沉積等異常情況(圖1(6)，圖1(9)～1(15))，少數(shù)組合出現(xiàn)花粉管打結(jié)現(xiàn)象(圖1(7)和1(8))，如映山紅×大字杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×薄皮杜鵑等.還有一些雜交組合，如錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑出現(xiàn)較多的異常類型.

圖1 雜交授粉后花粉管生長狀況分析Fig.1 Pollen tube growth after pollination

2.2 不同雜交組合花粉管生長狀況

2.2.1 映山紅雜交組合

如圖2所示，以映山紅作為母本時，所有雜交組合的花粉在授粉24后，映山紅自交、映山紅×映山紅(昆明)、映山紅×薄皮杜鵑以及映山紅×滇南杜鵑組合的花粉管已穿過花柱進入子房.其他雜交組合，其父本花粉也都能夠在柱頭表面萌發(fā)，但進入花柱通道內(nèi)的花粉管數(shù)量及異?；ǚ酃艿谋嚷?，因雜交組合不同而有所不同.進入花柱的花粉管數(shù)量大于50根的父本花粉，包括睫毛杜鵑、白花杜鵑、紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉，但紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉有70%以上出現(xiàn)花粉管異常現(xiàn)象.大白杜鵑、美容杜鵑、馬纓杜鵑及大字杜鵑萌發(fā)花粉中，進入花柱的花粉管數(shù)量較少，不到20根，但異?；ǚ酃鼙壤灿兴档?另外，映山紅×露珠杜鵑的雜交花粉，進入花柱的花粉管數(shù)量較少，但異常花粉管的比例很高.

圖2 授粉后花粉管在映山紅柱頭中生長狀況及異?；ǚ酃鼙壤鼺ig.2 Pollen tube growth on stigmas and into the style of R.simsii after pollination and frequency of abnormal pollen tubes

授粉72 h后，大部分雜交組合進入花柱中的花粉管數(shù)量均多于授粉后24 h，但映山紅×馬纓杜鵑組合進入花柱的花粉管數(shù)量未見增加，仍少于20.并且隨著進入花柱花粉管數(shù)量的增加，部分雜交組合，如映山紅×睫毛杜鵑和映山紅×大白杜鵑異?；ǚ酃艿谋壤苍谠黾?除了映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×白花杜鵑以及映山紅×窄葉杜鵑以外，大部分雜交組合在授粉72 h后，花粉管都伸入了子房.

授粉120 h后，各組合花粉管進入花柱的數(shù)量也有所增加(＞20根)，且各進入花柱的花粉管均能到達花柱底部.但個別組合，如映山紅×薄皮杜鵑、映山紅×滇南杜鵑異常花粉管的比例增高，主要表現(xiàn)為較嚴重的胼胝質(zhì)沉積、花粉管破裂等現(xiàn)象.其他組合也存在花粉管異?，F(xiàn)象，但比例較低，如映山紅×睫毛杜鵑、映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×美容杜鵑.

2.2.2 錦繡杜鵑雜交組合

授粉后花粉管在錦繡杜鵑柱頭中生長狀況及異?；ǚ酃鼙壤鐖D3所示.

圖3 授粉后花粉管在錦繡杜鵑柱頭中生長狀況及異常花粉管比例Fig.3 Pollen tube growth on stigmas and into the style of R.pulchrum after pollination and frequency of abnormal pollen tubes

由圖3可知，以錦繡杜鵑作為母本時，不同種類父本各花粉雖然亦能在柱頭表面萌發(fā)，但花粉粒附著數(shù)量、萌發(fā)數(shù)量與花粉管長度等卻存在顯著差異.授粉24 h后，大部分組合花粉在柱頭的附著量都較多，但白花杜鵑、窄葉杜鵑和滇南杜鵑花粉在母本柱頭的附著量較少，并且除錦繡杜鵑×滇南杜鵑以外各組合花粉管均能通過柱頭進入花柱.有部分組合萌發(fā)的花粉管數(shù)量在50根以上，如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大字杜鵑與錦繡杜鵑×睫毛杜鵑，但花粉管異常的比率高達31% ～100%.與映山紅為母本的雜交組合相比，大部分組合花粉管數(shù)量都比較少，并且可以發(fā)現(xiàn)，除了錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×白花杜鵑以外，較多花粉管存在胼胝質(zhì)過量沉積或者粗細不一現(xiàn)象.同時，僅部分組合的花粉管能夠在24 h內(nèi)達到花柱底部，如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大白杜鵑與錦繡杜鵑×白花杜鵑.

與授粉第24 h相比，授粉72 h后，大部分雜交組合中進入花柱的花粉管數(shù)量都有所增加，但是穿過花柱進入子房的雜交組合數(shù)量并未增多，僅部分組合的花粉管繼續(xù)向下生長，如錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑、錦繡杜鵑×窄葉杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花、錦繡杜鵑×滇南杜鵑，其中錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×滇南杜鵑等組合的花粉管的70%都存在異常現(xiàn)象.

授粉后120 h后，包括自交在內(nèi)的14個雜交組合當中，有8個雜交組合的花粉管進入花柱底部，其中錦繡杜鵑自交、錦繡杜鵑×映山紅(昆明)、錦繡杜鵑×白花杜鵑有較多花粉管到達花柱底部(＞50根)，異?；ǚ酃軘?shù)量較少(＜30%)，其他5個組合進入花柱底部的花粉管數(shù)量較少，并且錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑及錦繡杜鵑×美容杜鵑3個組合的異常花粉管比例較高.

3 討論

親和性授粉在花柱道和胎盤凹槽生長期間，花粉管是直的、末端半透明(稱為帽區(qū))，在帽區(qū)后邊相隔一定距離有規(guī)則的胼胝質(zhì)沉積［6］.映山紅、錦繡杜鵑自交、雜交后，花粉管的生長出現(xiàn)扭曲、螺旋、膨大、斷裂和胼胝質(zhì)過量沉積等異常情況.Williams等［6］在杜鵑遠緣雜交時還發(fā)現(xiàn)受精后花粉管末端漸縮、有尖刺等其他花粉管生長異?，F(xiàn)象.花粉管異常情況出現(xiàn)的類型與雜交親和性無直接聯(lián)系，即使自交的組合也發(fā)現(xiàn)花粉管螺旋、破損、胼胝質(zhì)過量沉積等異常的情形，部分組合如:錦繡杜鵑×薄皮杜鵑雜交組合，除以上異常狀況外，還發(fā)現(xiàn)花粉管打結(jié)、雜亂生長、先端膨大等異常，在所有異常情況中較多組合出現(xiàn)花粉管胼胝質(zhì)過量沉積、螺旋，而花粉管打結(jié)現(xiàn)象較少.

根據(jù)Williams等［6］在杜鵑花科遠緣雜交研究中的發(fā)現(xiàn)，花粉管的生長受阻可能發(fā)生在7個不同的部分:①花粉在柱頭表面無法萌發(fā);②花粉粒萌發(fā)，產(chǎn)生花粉管，但花粉管在柱頭表面發(fā)生異常;③花粉管進入花柱道，但在花柱道內(nèi)出現(xiàn)異常;④花粉管無法進入子房;⑤花粉管進入子房，但不能進入珠孔;⑥花粉管進入珠孔，但無法進入胚囊;⑦花粉管無法在胚囊內(nèi)釋放精子.不同雜交組合中花粉管生長受阻的部位存在種間差異.

該研究以映山紅作為母本雜交，各父本花粉都能夠在映山紅柱頭上附著并萌發(fā)，并且各父本花粉管基本上都能到達花柱下部，雖然不同雜交組合花粉管的生長速度、到達花柱基部的比率及異?；ǚ酃艿谋嚷实却嬖陲@著差異(圖2).個別組合，如映山紅×馬纓花、映山紅×滇南杜鵑雜交2個月后子房未見膨大［17］，但在研究中也觀察到有花粉管進入胚珠(圖1(14)).解瑋佳等［18］在高山杜鵑與大喇叭杜鵑(R.excellens)雜交時也有類似發(fā)現(xiàn)，即有花粉管進入胚囊，但未見子房膨大.花粉管進入胚囊，并不一定能夠完成受精作用，可能會出現(xiàn)胚囊不親和現(xiàn)象，即花粉管進入胚囊并釋放出精子，但精子卻不能有效地與雌配子結(jié)合實現(xiàn)雙受精，這在玉米等作物的遠緣雜交中也有報道［19］.在杜鵑雜交研究中發(fā)現(xiàn)，花粉管進入胚囊后，會因出現(xiàn)過度生長等情況，而無法完成受精［7］.該研究還發(fā)現(xiàn)部分雜交組合在萌發(fā)初期，或花柱中、上部出現(xiàn)異?；ǚ酃?，但在下部恢復(fù)正常，進入胚囊.Williams等［6］發(fā)現(xiàn)異常的花粉管也能伸入胚囊，但是否能順利完成受精，還需要進行進一步胚胎發(fā)育學(xué)研究.

錦繡杜鵑作為母本雜交時，僅種內(nèi)及映山紅組內(nèi)雜交72 h后，有花粉管進入花柱下部(圖3)，這幾個雜交組合也獲得了種子［17］.杜鵑亞屬、馬銀花亞屬以及同一亞屬不同組的大字杜鵑花粉管沒能到達花柱基部，在花柱通道內(nèi)花粉管的生長受阻，或因其生長速度過慢，在授粉72 h后花粉管仍未能達到花柱底部;并且這些雜交組合中異常花粉管的比率也較高(圖3).這些雜交組合在雜交后均未獲得雜交種子，雖然部分雜交組合，如錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×睫毛杜鵑等，雜交2個月后有子房膨大現(xiàn)象，但并未正常發(fā)育，形成種子［17］，這表明這些雜交組合同時存在受精后障礙.

整體來看，雜交親和性較好的組合，花粉管生長速度較快，到達花柱底部的花粉管比率較高，如映山紅自交及種內(nèi)雜交.Williams和Rouse［20］的研究表明，花粉管生長速度及進入子房的時間與雌蕊花柱長度有關(guān)，父本/母本的柱頭長度比(SLR)顯著影響種間雜交成功率，比值越接近1，雜交成功率越高.映山紅做母本時，花粉管到達花柱底部的雜交組合多于錦繡杜鵑母本，異常花粉管比率低(＜30%)，這表明作為母本，映山紅種間雜交親和性要優(yōu)于錦繡杜鵑.這一結(jié)果也表明母本的不同可能導(dǎo)致花粉管生長狀況不同;同種母本因父本的不同也可能對花粉管的生長情況有不同影響，Ureshino等［5］的研究中也有類似報道.

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