基于Hg2+誘導(dǎo)DNA雙鏈形成的汞離子檢測(cè)試紙條研制*

杜 娟, 婁新徽, 金慶輝, 趙建龍

(1.中國科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200050；

2.首都師范大學(xué)，北京 100048； 3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

0 引 言

Hg是一種高毒性的全球環(huán)境污染物，由于其具有高遷移性、不可降解性、生物富集性和食物鏈放大性的特點(diǎn)，即便是極微量的存在于環(huán)境中，也會(huì)對(duì)動(dòng)植物和人類的健康造成極大的威脅[1, 2]。Hg以多種形式存在于環(huán)境中，水溶性的Hg2+是汞污染最常見和最穩(wěn)定的形式之一。傳統(tǒng)的Hg2+檢測(cè)方法主要有：原子吸收法、原子熒光法、高效液相色譜法以及電感耦合等。盡管能夠得到比較精確的檢測(cè)結(jié)果，但這些技術(shù)依賴大型儀器設(shè)備、耗費(fèi)耗時(shí)、檢測(cè)成本高，很難滿足產(chǎn)地現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求[3]。隨后又發(fā)展了一些基于有機(jī)發(fā)色團(tuán)[4]、有機(jī)熒光小分子[5]以及共軛聚合物[6]的傳感技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)方法，這些方法具有簡單、經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)勢(shì)，但是卻有水溶性差、靈敏度低、選擇性局限的缺點(diǎn)。因此，人們迫切需要簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的Hg2+檢測(cè)分析方法。

近年來的研究表明[7, 8]，Hg2+能特異性地與2個(gè)胸腺嘧啶堿基(T)共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)?；贖g2+的這一特性，已發(fā)展了各種檢測(cè)方法，如納米金比色法[9～14]、熒光分析法[8, 15～21]、電化學(xué)法[22～24]等。層析試紙檢測(cè)技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)技術(shù)，由于其具有快捷、靈敏、成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)，在快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。本文利用Hg2+與T形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的這一特性，以層析試紙為檢測(cè)平臺(tái)，設(shè)計(jì)了一種可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)溶液中Hg2+濃度的檢測(cè)試紙條，檢測(cè)結(jié)果裸眼觀察可見，并可通過金標(biāo)條閱讀儀進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

雙維平面劃膜儀和全自動(dòng)斬切機(jī)(上海金標(biāo)生物科技公司)；DGG—9053A型恒溫干燥箱(韓國Sumsung公司)；QimageRetiga 2000R數(shù)碼相機(jī)(日本Olympus公司)；DJM—4金標(biāo)條閱讀儀(中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所)；V—670紫外—可見分光光度計(jì)(美國Jasco公司)；JEM—21O0透射電子顯微鏡(TEM，日本電子公司)；Centrifuge5804R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

納米金溶液由本實(shí)驗(yàn)室自行制備；金標(biāo)稀釋液(30 %蔗糖，0.25 %吐溫20，0.25 % SDS，pH=7.2)；MOPS緩沖液(100 mmol/L NaNO3, 10 mmol/L MOPS,pH=7.2)；DNA探針由上海生物工程技術(shù)有限公司合成(見表1)；二水合雙(對(duì)—磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽(bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphinedihydratedipotassium，BSPP)、三(2—羧乙基)膦鹽酸鹽(Tris(2—carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、3—嗎啉代丙磺酸(3—(N-morpholino) propanesulfo-nic，MOPS)均購自美國Sigma-Aldrich公司；鏈親和素(美國New England Biolabs公司)；標(biāo)準(zhǔn)汞儲(chǔ)存液(美國AccuStandard公司)；其它試劑為分析純。

層析試紙條材料：結(jié)合墊(SB06玻璃纖維)、樣品墊、硝酸纖維素膜(180 s)、吸水墊(CH27吸水紙)和聚氯乙烯(PVC)背板、塑料外殼均購于上?？祆`生物科技公司。

表1 核酸探針序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米金顆粒的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑約為13 nm的納米金顆粒溶膠。待用玻璃器皿和磁力攪拌子用王水(HCl∶HNO33∶1)浸泡并用去離子水沖洗干凈，置于烘箱內(nèi)直至干燥。將250 mL的1 mmol/L的四氯金酸(HAuCl4)溶液均勻加熱至沸騰10 min。在高速攪拌下快速加入38.8 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液25 mL，繼續(xù)加熱攪拌15 min。停止加熱后繼續(xù)攪拌，自然冷卻至室溫。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米金探針的標(biāo)記

將10 mL的13 nm的納米金原液與20 mg BSPP混合，搖床劇烈震動(dòng)過夜，加入5 mol/L NaNO3直至納米金變成藍(lán)色，將混合溶液在25 ℃，13 000 rpm，15 min離心至納米金顆粒完全凝聚，棄上清，加入5 mL的 mg/mL BSPP水溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。? μL的1 mol/LTCEP溶液加入600 μL的5 μmol/L巰基修飾的檢測(cè)探針溶液(PB緩沖液)中混合均勻，室溫放置30 min，后加入600 μL制備好的BSPP—納米金溶液，混勻后在4 ℃冰箱內(nèi)靜止16 h，逐步分次加入1 mol/L NaNO3,10 mmol/L PBS直至最終混合溶液Na+濃度達(dá)到150 mmol/L，在4 ℃冰箱內(nèi)靜止48 h，放入離心機(jī)在4 ℃，9 000 rpm，50 min離心，棄上清，加入150 mmol/L NaNO3和10 mmol/L PBS重復(fù)洗脫2次，最后儲(chǔ)存于金標(biāo)稀釋液中。

1.2.3 捕獲探針的制備

將100 μmol/L生物素修飾的捕獲探針溶液(Probe1/2/3)分別與1 g/L鏈親和素等體積混合，室溫靜止1 h后作為捕獲探針備用。

1.2.4 試紙條的制作

用雙維平面劃膜儀將捕獲探針以1 μL/cm的濃度分別固定在NC膜上，間隔為5 mm，作為檢測(cè)線T1,T2和控制線C，干燥后封閉備用；用金標(biāo)稀釋液將納米金探針稀釋后噴涂在結(jié)合墊上，37 ℃干燥過夜。在PVC背板上依次粘貼硝酸纖維素膜(NC膜)、結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊，然后用全自動(dòng)斬切機(jī)切成寬度為3.5 mm的試紙條，壓入塑料外殼中，密封干燥保存。

1.2.5 靈敏度與選擇性測(cè)試

在MOPS緩沖液中標(biāo)準(zhǔn)添加Hg2+原液，配置不同濃度的Hg2+溶液，將50μL Hg2+溶液加入試紙條加樣孔，水平靜止5 min，待納米金探針完全由結(jié)合墊遷移至吸收墊，即可用觀察條帶顏色變化，然后將試紙條放入DJM—4金標(biāo)條閱讀儀進(jìn)一步分析檢測(cè)結(jié)果。

在MOPS緩沖液中標(biāo)準(zhǔn)添加常見二價(jià)重金屬離子，配制Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+溶液用于選擇性測(cè)試。

1.2.6 飲用水中的Hg2+檢測(cè)

飲用水來源于實(shí)驗(yàn)室，在飲用水中標(biāo)準(zhǔn)添加一定量的Hg2+原液，配制不同濃度的Hg2+溶液，將檢測(cè)結(jié)果與MOP緩沖液中Hg2+檢測(cè)結(jié)果對(duì)照。

1.2.7 穩(wěn)定性測(cè)試

將制備好的試紙條置于室溫放置的干燥器中，分別在第1,2,4,8周取出測(cè)定，觀察條帶的顏色和試紙條的靈敏度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

本研究旨在構(gòu)建一種靈敏快速的試紙條，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)溶液中Hg2+濃度。該試紙主要由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸收墊四部分組成，包含2條測(cè)試線T1,T2和1條控制線C，試紙條結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。探針序列設(shè)計(jì)見表1。根據(jù)檢測(cè)序列，標(biāo)記在納米金上的AuNP Probe中的一段序列(A20)與測(cè)試線T1捕獲探針Probe1完全互補(bǔ)，Probe1為寡核酸鏈T20，對(duì)Hg2+具有識(shí)別作用。檢測(cè)探針另一段序列與控制線C捕獲探針Probe2完全互補(bǔ)，同時(shí)與測(cè)試線T2捕獲探針Probe2構(gòu)成對(duì)Hg2+具有特異性的識(shí)別探針。檢測(cè)原理如圖1(b)所示，當(dāng)待測(cè)樣品中無Hg2+存在時(shí)，納米金探針被Probe1和Probe3捕獲，T1線和C線顯紅色。當(dāng)待測(cè)樣品中存在Hg2+時(shí)，介導(dǎo)T—T錯(cuò)配形成比A-T穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，Probe1自身形成雙鏈結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致捕獲的納米金探針量減少，T1線顏色變淡至消失；Probe2在Hg2+的介導(dǎo)作用下捕獲納米金探針，T2線顯紅色并隨Hg2+濃度提高顏色加深；Probe3捕獲納米金探針不受Hg2+影響，C線始終顯紅色，指示試紙條是否正常工作。

圖1 試紙條結(jié)構(gòu)示意圖和Hg2+檢測(cè)原理圖

2.2 納米金探針制備與分析

將制備好的納米金溶液用透射電子顯微鏡(TEM)觀察，其結(jié)果如圖2所示，制備的納米金粒子平均粒徑為13±3 nm，大小均勻，形態(tài)穩(wěn)定。

圖2 納米金溶液TEM圖像

納米金原液與納米金探針經(jīng)紫外—可見分光光度計(jì)掃描，圖3(a)顯示納米金原液A在520 nm波長附近有最大吸收峰，BSPP納米金(B)最大吸收峰在522 nm處，而標(biāo)記了單鏈DNA后的納米金探針C最大吸收峰在525 nm處，較原液紅移了約5 nm。圖3(b)所示為瓊脂糖電泳圖，納米金原液A聚集在點(diǎn)樣孔并在電泳液中鹽離子濃度下發(fā)生聚集而變藍(lán)；BSPP納米金B(yǎng)穩(wěn)定性增強(qiáng)，未發(fā)生聚集，有明顯條帶；標(biāo)記了單鏈DNA的納米金探針C由于DNA的牽制導(dǎo)致其電泳速率比BSPP納米金緩慢。綜上所述，單鏈DNA標(biāo)記納米金探針是成功的。

圖3 紫外—可見吸收譜和瓊脂糖電泳圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中Hg2+檢測(cè)結(jié)果

用試紙條分別對(duì)MOPS緩沖液中濃度為0,0.1,1,10,100 μmol/的Hg2+進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別如圖4(a)所示，T1線顏色隨Hg2+濃度升高而減弱直至消失，T2線顏色隨Hg2+濃度升高增強(qiáng)，裸眼可見檢測(cè)靈敏度約為100 nmol/L。用DJM—4金標(biāo)條閱讀儀分析檢測(cè)結(jié)果，以測(cè)試線與控制線信號(hào)強(qiáng)度比值(T1/C，T2/C)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，繪制曲線如圖4(b)所示，可見該試紙的檢測(cè)結(jié)果在10 nmol/L～10 μmol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

圖4 試紙條檢測(cè)緩沖液中不同濃度Hg2+結(jié)果和信號(hào)—濃度曲線圖

2.4 對(duì)其他重金屬離子的選擇性

用試紙條分別對(duì)MOPS緩沖液中1 μmol/L的Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+以及Hg2+進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果照片和金標(biāo)條閱讀儀掃描信號(hào)分別如圖5(a)和圖5(b)所示，可見該試紙對(duì)常見二價(jià)重金屬離子具有良好的選擇性。

圖5 試紙條檢測(cè)1 μmol/L Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+結(jié)果圖和信號(hào)對(duì)比

2.5 飲用水中的Hg2+檢測(cè)結(jié)果

用試紙條分別對(duì)飲用水中濃度為0,0.1,1,10,100 μmol/L的Hg2+進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別如圖6(a)所示。分別取0,1,100 μmol/L飲用水中Hg2+檢測(cè)結(jié)果與MOPS緩沖液中Hg2+檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，金標(biāo)條閱讀儀器分析結(jié)果如圖6(b)所示，檢測(cè)結(jié)果基本無差別，因此,該試紙可用于飲用水中的Hg2+快速檢測(cè)。

圖6 試紙條檢測(cè)飲用水中不同濃度Hg2+檢測(cè)結(jié)果圖和緩沖液與飲用水中Hg2+檢測(cè)信號(hào)對(duì)比圖

2.6 試紙條穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

分別在試紙條制備的第1,2,4,8周從干燥箱內(nèi)取出試紙進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:在室溫保存8周的試紙條，條帶顏色和檢出限與新制備的試紙條沒有明顯差異，說明在室溫干燥條件下，該試紙條至少可保存2個(gè)月。

3 結(jié) 論

本文成功研制出一種可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的汞離子檢測(cè)試紙條，檢測(cè)結(jié)果在5 min內(nèi)顯示，裸眼可見靈敏度約為100 nmol/L，金標(biāo)條閱讀儀分析結(jié)果在10 nmol/L～10 μmol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，對(duì)常見二價(jià)重金屬離子具有良好的選擇性。與傳統(tǒng)汞離子檢測(cè)方法相比，該方法快捷靈敏、操作簡單、成本低廉、易于存放，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等方面具有很好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

[1]Magos L，Clarkson T W.Overview of the clinical toxicity of mercury[J].Annals of Clinical Biochemistry，2006，43(4)：257-268.

[2]Zahir F，Rizwi S J，Haq S K，et al.Low dose mercury toxicity and human health[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2005，20(2)：351-360.

[3]Leermakers M，Baeyens W，Quevauviller P，et al.Mercury in environmental samples: Speciation, artifacts and validation[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2005，24(5)：383-393.

[4]Guo X，Qian X，Jia L.A highly selective and sensitive fluorescent chemosensor for Hg2+in neutral buffer aqueous solution[J].Journal of the American Chemical Society，2004，126(8)：2272-2273.

[5]Nolan E M，Lippard S J.Tools and tactics for the optical detection of mercuric ion[J].Chem Rev，2008，108(9)：3443-3480.

[6]Tang Y，He F，Yu M，et al.A reversible and highly selective fluorescent sensor for mercury(II)using poly(thiophene)s that contain thymine moieties[J].Macromolecular Rapid Communications，2006，27(6)：389-392.

[7]Miyake Y，Togashi H，Tashiro M，et al.Mercury II-mediated formation of thymine-Hg(II)-thymine base pairs in DNA duplexe-s[J].Journal of the American Chemical Society，2006，128(7)：2172-2173.

[8]Ono A，Togashi H.Highly selective oligonucleotide-based sensor for mercury (II) in aqueous solutions[J].Angewandte Chemie International Edition，2004，43(33)：4300-4302.

[9]Lee J S，Han M S，Mirkin C A.Colorimetric detection of mercuric ion (Hg2+) in aqueous media using DNA-functionalized gold nanoparticles[J].Angewandte Chemie，2007，119(22)：4171-4174.

[10] Xue X，Wang F，Liu X.One-step, room temperature, colorimetric detection of mercury (Hg2+) using DNA/nanoparticle conjugates[J].Journal of the American Chemical Society，2008，130(11)：3244-3245.

[11] Li D，Wieckowska A，Willner I.Optical analysis of Hg2+ions by oligonucleotide-gold-nanoparticle hybrids and DNA-based machines[J].Angewandte Chemie，2008，120(21)：3991-3995.

[12] Wang H，Wang Y，Jin J，et al.Gold nanoparticle-based colorime-tric and “turn-on” fluorescent probe for mercury (II) ions in aqueous solution[J].Analytical Chemistry，2008，80(23)：9021-9028.

[13] Li L，Li B，Qi Y，et al.Label-free aptamer-based colorimetric detection of mercury ions in aqueous media using unmodified gold nanoparticles as colorimetric probe[J].Analytical and Bioanaly-tical Chemistry，2009，393(8)：2051-2057.

[14] Li T，Dong S，Wang E.Label-free colorimetric detection of aqueous mercury ion (Hg2+) using Hg2+-modulated G-quadruplex-based DNAzymes[J].Analytical Chemistry，2009，81(6)：2144-2149.

[15] Liu X，Tang Y，Wang L，et al.Optical detection of mercury (II) in aqueous solutions by using conjugated polymers and label-free oligonucleotides[J].Advanced Materials，2007，19(11)：1471-1474.

[16] Freeman R，F(xiàn)inder T，Willner I.Multiplexed analysis of Hg2+and Ag+ions by nucleic acid functionalized CdSe/ZnS quantum dots and their use for logic gate operations[J].Angewandte Chemie International Edition，2009，48(42)：7818-7821.

[17] Liu J，Lu Y.Rational design of “turn-on” allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity[J].Angewandte Chemie，2007，119(40)：7731-7734.

[18] Lee J.Highly sensitive “turn-on” fluorescent sensor for Hg2+in aqueous solution based on structure-switching DNA[J].Chemical Communications，2008，45：6005-6007.

[19] Ye B C，Yin B C.Highly sensitive detection of mercury (II) ions by fluorescence polarization enhanced by gold nanoparticles[J].Angewandte Chemie International Edition，2008，47(44)：8386-8389.

[20] Liu C W，Huang C C，Chang H T.Highly selective DNA-based sensor for lead (II) and mercury (II) ions[J].Analytical Che-mistry，2009，81(6)：2383-2387.

[21] Ren X，Xu Q H.Highly sensitive and selective detection of mercury ions by using oligonucleotides, DNA intercalators, and conjugated polymers[J].Langmuir，2008，25(1)：29-31.

[22] Kong R M.，Zhang X B，Zhang L L，et al.An ultrasensitive electrochemical “turn-on” label-free biosensor for Hg2+with AuNP-functionalized reporter DNA as a signal amplifier[J].Chem Commun，2009，37：5633-5635.

[23] Wu D，Zhang Q，Chu X，et al.Ultrasensitive electrochemical sensor for mercury (II) based on target-induced structure-switching DNA[J].Biosensors and Bioelectronics，2010，25(5)：1025-1031.

[24] Zhu Z，Su Y，Li J，et al.Highly sensitive electrochemical sensor for mercury (II) ions by using a mercury-specific oligonucleotide probe and gold nanoparticle-based amplification[J].Analytical Chemistry，2009，81(18)：7660-7666.