微生物制劑在幼齡反芻動物營養(yǎng)與飼料中的應(yīng)用

刁其玉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081)

微生態(tài)制劑(mcrobiolecological agents)的概念，1998年由Guarner和Schaafsma確定為，在微生態(tài)學(xué)理論指導(dǎo)下，調(diào)整微生態(tài)平衡失調(diào)，保持微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進(jìn)宿主正常菌群生長的物質(zhì)制劑總稱［1］。它涵蓋益生菌活菌及其代謝產(chǎn)物和滅活菌。目前世界上已有不少的國家頒布法令，禁止在動物飼料中添加抗生素，對抗生素在畜牧業(yè)中的使用控制得更加嚴(yán)格。微生物制劑作為綠色飼料添加劑克服了抗生素所帶來的負(fù)面影響，越來越受到重視，其開發(fā)和應(yīng)用對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了積極的作用，光輝的抗生素時代之后，將是一個嶄新的微生態(tài)時代。幼畜階段是動物一個重要的生理時期，這個階段的生長發(fā)育關(guān)系到其一生中的健康與生產(chǎn)性能，初生動物的消化道基本是微生物的空白，引入微生物制劑促進(jìn)幼畜消化系統(tǒng)發(fā)育和機(jī)體健康，無疑是從起點抓起，微生物制劑對幼畜的效果會從不同的方面得以體現(xiàn)，本文就本團(tuán)隊近年來的部分工作作一綜述。

1 幼齡反芻動物應(yīng)用微生物制劑的特殊性

關(guān)于微生物制劑在反芻動物營養(yǎng)與飼料中的應(yīng)用一直存在爭議。有觀點認(rèn)為，反芻動物具有龐大的瘤胃微生物區(qū)系，微生物種類和數(shù)量巨多，額外添加微生物制劑作用不明顯。也有觀點認(rèn)為，盡管反芻動物的瘤胃功能強(qiáng)大，但通過優(yōu)化瘤胃內(nèi)的主導(dǎo)菌群結(jié)構(gòu)，補(bǔ)充缺少的微生物，可以對瘤胃內(nèi)環(huán)境起到積極作用。

新生動物要經(jīng)歷營養(yǎng)、環(huán)境和心理三大方面的應(yīng)激，從胚胎期胎兒的生存環(huán)境溫度的穩(wěn)定到出生后的變溫環(huán)境;無菌羊水的胎盤到有菌的圈舍;胎兒養(yǎng)分從由臍帶供給到出生后由消化道主動吸收，出生是新生動物的第1個應(yīng)激［2］。幼齡動物適應(yīng)了母乳之后，快速生長發(fā)育，隨后又迎來第2個應(yīng)激，即斷奶應(yīng)激，斷奶時經(jīng)歷與母親的分開，完成從采食液體母乳到固體配合飼糧的轉(zhuǎn)變，營養(yǎng)成分也從母乳中富含的脂肪、乳糖和酪蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w飼料中含有的植物蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等營養(yǎng)素，這一系列的生理應(yīng)激發(fā)生在豬的3～4周、反芻動物的8周之內(nèi)，可以說動物的幼齡生長發(fā)育充滿了機(jī)遇與風(fēng)險，是幼畜必須闖過的關(guān)口。

普遍認(rèn)為，微生物制劑在動物體內(nèi)的主要功能有:維持腸道正常微生物菌群;改善新陳代謝，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收［3-4］。因此，應(yīng)用微生物制劑可以提高動物生長率，降低死亡率，改善飼料轉(zhuǎn)化率［5］，提高動物免疫力，增強(qiáng)抗病力，刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生不同類型細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)起重要作用［6］。這些效果是否會在幼齡反芻動物的生長發(fā)育中發(fā)揮作用，受不同環(huán)境和飼料條件的影響，目前微生物制劑在反芻動物，特別是幼齡反芻動物的應(yīng)用研究成為熱點。幼齡反芻動物處于胃腸道快速發(fā)育的階段，此時的營養(yǎng)和調(diào)節(jié)劑供給更需要關(guān)注對幼畜胃腸道健康、瘤胃微生物區(qū)系建立、免疫機(jī)能建立的作用效果，最大程度地降低生理應(yīng)激，保障幼畜的健康發(fā)育。

2 微生物制劑在幼齡反芻動物上的應(yīng)用效果

幼齡反芻動物飼糧中添加微生物制劑的作用一直也模棱兩可，有些研究證實其可以提高生長性能，而有些研究則反映沒有影響。Frizzo等［7］和Signorini等［8］采用 Meta 分析法統(tǒng)計了 1980—2010年發(fā)表的66篇文獻(xiàn)，這些研究都是針對飼喂牛奶或代乳品的未斷奶犢牛的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂的微生物制劑主要集中于乳酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、屎腸球菌，且提高了飼喂代乳粉犢牛的飼料轉(zhuǎn)化率和生長率，因此微生物制劑可作為抗生素的替代品用于促進(jìn)犢牛生長;添加乳酸桿菌可降低飼喂全奶犢牛的腹瀉發(fā)生率和改變糞便中乳酸桿菌∶大腸桿菌，但對飼喂代乳粉的犢牛沒有影響。添加納豆芽孢桿菌可促進(jìn)斷奶后犢牛瘤胃及腸道中主要的纖維分解菌(如琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和脂解厭氧弧桿菌)在消化道中的定植和生長［9］。地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物增加了瘤胃內(nèi)中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和有機(jī)物質(zhì)的表觀消化率［10］。

2.1 微生物制劑對哺乳期犢牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

新生反芻動物的消化道幾乎是無菌狀態(tài)，胃腸道pH接近中性，有利于腸道病原菌的生長。飼喂微生物制劑可以促進(jìn)其瘤胃發(fā)育和調(diào)節(jié)瘤胃pH，并能促進(jìn)犢牛提前斷奶。本團(tuán)隊成員符運勤［11］以地衣芽孢桿菌(B組)、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合菌(C組)、地衣芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌和植物乳酸桿菌三者復(fù)合菌(D組)飼喂0～8周齡哺乳期犢牛，與不添加微生物制劑的對照組(A組)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，飼糧中添加地衣芽孢桿菌單菌顯著提高了犢牛平均日增重(ADG)和體軀指數(shù);各試驗組糞便評分有降低的趨勢，血清生化指標(biāo)差異不顯著。通過對瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃液細(xì)菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)及PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加地衣芽孢桿菌及其復(fù)合菌可以提高犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的穩(wěn)定性，提高了8周齡犢牛瘤胃液細(xì)菌種類數(shù)目和優(yōu)勢條帶數(shù)，促進(jìn)了瘤胃纖維分解菌的定植和繁衍(表1)。從而可推斷，地衣芽孢桿菌及其復(fù)合菌具有調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)環(huán)境、提高機(jī)體抵御飼養(yǎng)條件變化所帶來的應(yīng)激等的能力，促進(jìn)犢牛健康生長。

表1 地衣芽孢桿菌及其復(fù)合菌對0～8周齡犢牛瘤胃纖維分解菌的影響(灰度值的對數(shù))Table 1 Effects of Bacillus licheniformis and its compound bacteria on rumen cellulytic bacteria in calves aged 0 to 8 weeks(data was transformed by natural logarithm of grayscale)

續(xù)表1

地衣芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、植物乳酸桿菌復(fù)合情況下對哺乳期犢牛具有積極作用，而地衣芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合則效果略差，益生菌之間存在組合效應(yīng)。

本團(tuán)隊成員董曉麗［12］以枯草芽孢桿菌和植物乳酸桿菌為研究對象，分別給哺乳期犢牛飼喂基礎(chǔ)飼糧(CT組)、基礎(chǔ)飼糧+植物乳桿菌［1.7×1010CFU/(h·d)，LB組］、基礎(chǔ)飼糧 +植物乳桿菌［8.6×109CFU/(h·d)］+枯草芽孢桿菌［2.0×108CFU/(h·d)］(LBS組)。哺乳期犢牛飼喂微生物制劑后瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系DGGE圖譜如圖1。從圖中可以看出，添加的植物乳桿菌(泳道1)和枯草芽孢桿菌(泳道14)的條帶均未出現(xiàn)在其他泳道中，說明瘤胃中未檢測到試驗添加的益生菌。哺乳期犢牛瘤胃微生物的條帶位于圖譜的中下部，不同處理的犢牛瘤胃內(nèi)出現(xiàn)相同的微生物，如標(biāo)有箭頭序號2、14、18、21的條帶;不同處理間出現(xiàn)很多特異性條帶，如標(biāo)有箭頭的 1、4、5、10、12、16。

表2表示的是飼喂微生物制劑對犢牛瘤胃微生物多樣性指數(shù)的影響。從表中可以看出，不同處理的多樣性指數(shù)香儂-威納多樣性指數(shù)(Shannon-Weiner diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson’s diversity index)、均勻度(evenness index)及豐度(richness)均無顯著性差異。

表3為植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌對斷奶后犢牛瘤胃常見細(xì)菌數(shù)量的影響，犢牛飼喂植物乳桿菌及其與枯草芽孢桿菌的復(fù)合物后，相同處理的犢牛瘤胃微生物未聚合在一起，且微生物多樣性指數(shù)無顯著性差異。代乳品中添加植物乳桿菌及植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合菌對犢牛常見瘤胃細(xì)菌數(shù)量未發(fā)生變化，這驗證了不同菌種、不同菌種組合在反芻動物營養(yǎng)中的作用效果是有差異的［12］。

而繼續(xù)飼喂?fàn)倥Ｉ鲜鑫⑸镏苿跀嗄毯?～2周，飼喂植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌條件下的犢牛的瘤胃微生物區(qū)系受到影響，飼喂同樣微生物制劑的犢牛，其瘤胃微生物在DGGE分析中聚合在一起，同時瘤胃黃色球菌和白色瘤胃球菌均顯著降低［12］。

2.2 微生物制劑對哺乳期犢牛生長性能的影響

添加微生物制劑對哺乳期犢牛的生長性能有一定的影響。董曉麗［12］研究證實，在整個試驗期及試驗各階段0～2周齡、3～4周齡、5～6周齡和7～8周齡，各組犢牛的平均日增重、總干物質(zhì)采食均差異不顯著。然而添加微生物制劑具有增加平均日增重的趨勢，即整個試驗期平均日增重:LB組＞LBS組＞CT組。試驗2～4周齡、4～6周齡和6～8周齡，犢牛的飼料轉(zhuǎn)化率無顯著性差異;0～2周齡LB組的犢牛飼料轉(zhuǎn)化率得到顯著改善，整個試驗期飼料轉(zhuǎn)化率具有改善的趨勢，植物乳桿菌組優(yōu)于復(fù)合菌組優(yōu)于對照組(表4)。

圖1 斷奶前犢牛瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)的PCR-DGGE圖譜Fig.1 DGGE of PCR products of V3 regions of 16S rRNA gene of bacterium in rumen of pre-weaned calves

表2 參試微生物制劑對8周齡犢牛瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of test probiotics on diversity indices of ruminal bacterium in calves aged 8 weeks

本團(tuán)隊成員周盟［13］使用董曉麗［12］相同的試驗設(shè)計，測定微生物制劑對營養(yǎng)素消化率的影響，結(jié)果表明，飼喂植物乳酸桿菌及其與枯草芽孢桿菌組合菌的犢牛，營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率提高，特別是磷的表觀消化率顯著提高，與對照組相比，氮的表觀消化率提高了5.95%和7.35%，氮利用率(存留氮/攝入氮)提高了11.87%和13.99%，氮表觀生物學(xué)價值(存留氮/吸收氮)提高了5.70%和6.34%(表5)。

表4 微生物制劑對哺乳期犢牛生長性能的影響Table 4 Effects of probiotics on growth performance of pre-weaned calves

表5 植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌對斷奶后犢牛營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響Table 5 Effects of Lactobacillus and Bacillus subtilis on nutrient digestion and metabolism of post-weaned calves

符運勤［11］給犢牛飼喂前述微生物制劑，在0～2周齡、5～6周齡和7～8周齡，各組平均日增重均無顯著差異(表6)，而在3～4周齡，地衣芽孢桿菌(B)組平均日增重顯著高于對照(A)組和地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌(C)組，地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+植物乳酸桿菌(D)組在數(shù)值上高于C組(366.89 vs.232.00 g/d，P=0.08)和 A 組(366.89 vs.278 g/d，P=0.50)，在整個試驗期，B組的平均日增重顯著高于A組，C組和D組在數(shù)值上高于A組，但差異不顯著。

表6 微生物制劑對犢牛平均日增重的影響Table 6 Effects of probiotics on average daily gain of calves g/d

微生物制劑對8～52周齡后備牛生長性能也具有影響。付運勤［11］在前期(0～8周齡)試驗的基礎(chǔ)上，給斷奶后犢牛飼喂地衣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌 +植物乳酸桿菌，直至52周齡，荷斯坦后備牛體重和體長均有提高的趨勢(表7)，添加地衣芽孢桿菌對提高后備牛的體重有一定的作用，而地衣芽孢桿菌與其他菌的復(fù)合菌作用不穩(wěn)定，不同菌種復(fù)合作用效果有一定的變異。

表7 參試微生物制劑對后備牛體重和體況的影響Table 7 Effects of test probioics on body weight and dementionen of replacement cattle

2.3 地衣芽孢桿菌在幼齡動物體內(nèi)的定植觀察

上文所描述的結(jié)果證明了地衣芽孢桿菌對后備牛生長性能的提高及瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定作用明顯，但是地衣芽孢桿菌在動物胃腸道中是否可以定植是一個值得關(guān)注的事情。芽孢桿菌在其生長發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成一個圓形或橢圓形、厚壁、含水量極低、抗逆性極強(qiáng)的休眠體，即為芽孢。前人的研究表明，芽孢桿菌芽孢能在單胃動物消化的過程中被消化道環(huán)境激活，并以活性形式存在，在消化道內(nèi)萌發(fā)甚至繁殖，最終在糞便中排出［14-15］。地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的芽孢可以在豬的胃腸道中萌發(fā)，但只有很少的營養(yǎng)細(xì)胞能夠生長，停喂后糞便中的芽孢數(shù)逐漸降低，在停喂10～11 d后，糞便中的芽孢數(shù)與對照組相近，都在1×104CFU/g左右，說明地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌不能在豬消化道內(nèi)定植［14］。將納豆芽孢桿菌投入到奶牛瘤胃后，其糞便中的芽孢數(shù)逐漸降低，48 h后芽孢數(shù)已經(jīng)低于1×103CFU/g［16］。本研究團(tuán)隊符運勤［11］選取從出生一直飼喂地衣芽孢桿菌到52周齡后備牛，與出生后一直未曾飼喂芽孢桿菌的后備牛進(jìn)行比較。前者在停喂地衣芽孢桿菌后，在第 1、3、5、7、14 天當(dāng)天晨飼前直腸采集糞便測定芽孢數(shù)。結(jié)果表明，隨著停喂天數(shù)的增加，后備牛糞便芽孢數(shù)在顯著降低，在停喂1和3 d時，芽孢數(shù)顯著高于后者，但是停喂5 d及以后，2組牛糞便芽孢數(shù)相當(dāng)，均低于1×107CFU/g，見表8。說明地衣芽孢桿菌也不能在后備牛腸道中大量繁殖，需要在飼糧中持續(xù)添加。

表8 地衣芽孢桿菌停喂后不同時間點糞便中芽孢數(shù)Table 8 Spore counts in faeces at different sampling time after no feeding Bacillus licheniformis lg(CFU/g)

3 小結(jié)與展望

毋容置疑，微生物制劑在動物營養(yǎng)與飼料中的應(yīng)用將越來越得到重視，微生態(tài)制劑也將成為飼料工業(yè)投入品的核心之一。對于反芻動物，瘤胃是一個復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，不僅有細(xì)菌，還有真菌和原蟲等，而且這些微生物之間是相互作用的，將構(gòu)成一個完整的微生物區(qū)系，這個區(qū)系直接關(guān)系到動物的健康和生產(chǎn)性能。牛羊等反芻動物出生時消化系統(tǒng)類似于單胃動物，幾天之后瘤胃內(nèi)就有微生物活動，幾周后動物就有反芻行為，幾個月后就具有利用粗飼料的能力。這個特殊的時期的微生物發(fā)生與發(fā)展是一個值得開展深入的試驗和研究，建立平衡健康的微生態(tài)環(huán)境和微生物區(qū)系無疑是對動物健康的一個基本保障，建立更加完善的瘤胃內(nèi)環(huán)境將有利于動物的生產(chǎn)性能發(fā)揮和機(jī)體發(fā)育。

目前主要用動物的生長性能、瘤胃細(xì)菌數(shù)量、瘤胃內(nèi)環(huán)境因素評價微生物制劑的作用，均屬于表觀上分析微生物制劑的作用。如果將判斷指標(biāo)向瘤胃微生物的總量和結(jié)構(gòu)、向不同的目標(biāo)基因及其表達(dá)量方面進(jìn)展，將更有利于解釋外來益生菌對瘤胃微生物的影響作用;同時微生物制劑和其他益生素如天然物、低聚糖等的配伍也將是今后的一個研究熱點。

致謝:本團(tuán)隊成員董曉麗、周盟和符運勤等同學(xué)圍繞益生菌在幼齡反芻動物的生理營養(yǎng)項目，開展了大量研究工作，獲得了第一手資料，本文的主要數(shù)據(jù)來自她們的論文，特此致謝。

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