維藥睡蓮花沒(méi)食子酸的含量測(cè)定

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830004

維藥睡蓮花沒(méi)食子酸的含量測(cè)定

李晨陽(yáng)趙軍徐芳譚為陳燕

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830004

目的建立維藥睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法采用HPLC法測(cè)定，色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250mm × 4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇：0.05ml/l磷酸二元梯度洗脫，流速：1.0ml/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為273nm。結(jié)果沒(méi)食子酸在0.00196～0.0784mg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，加樣回收率為98.12%，RSD為1.79%(n=6)；樣品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于規(guī)范和控制維藥睡蓮花藥材的質(zhì)量。

睡蓮花；沒(méi)食子酸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

Abstract:ObjectiveTo establish the determination method ofNymphaeacandidaPresl. for determining gallic acid with HPLC.MethodThe HPLC separation was performed on a Agilent Eclipse XDB-C18column(250mm×4.6mm，5μm) in gradient elute mode with a mixture consisting of methol and 0.5ml/L phosphate acid solution at 30°C, the flow rate was 1.0ml/min, the detection wavelength was set at 273nm.ResultThe calibration curve of gallic acid was linear in the range of 0.00196～0.0784mg/ml (r=0.9999); the average recovery of quercitrin was 98.12% (RSD=1.79%,n=6)，and the properties of sample solution kept steady within 32 hours.ConclusionThe method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the quality control of Nymphaea candida Presl.

Keywords:NymphaeacandidaPresl；gallic acid；HPLC；determination

睡蓮花(NymphaeacandidaPresl.)為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮的干燥花蕾，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神之功效，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》，是維吾爾醫(yī)常用的單方或復(fù)方抗病毒藥中的主要成分。該藥材在維吾爾醫(yī)中用藥歷史久遠(yuǎn)，主要用于熱癥引起的頭痛，熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等病癥的治療。睡蓮屬植物大部分原產(chǎn)北非和東南亞熱帶地區(qū)，少數(shù)產(chǎn)于南非、歐洲和亞洲的溫帶和寒帶地區(qū)，國(guó)內(nèi)從云南至東北，往西至新疆均有分布。本論文采用高效液相色譜法測(cè)定了睡蓮花中沒(méi)食子酸的含量，為后期睡蓮花質(zhì)量控制的提高和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可見(jiàn)檢測(cè)器(日本島津有限公司)；梅特勒AL204型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；HH-W600三用恒溫水箱(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；AS10200AD型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-200302，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇為色譜純(Fisher)；水為娃哈哈純凈水；磷酸等其他試劑為分析純。雪白睡蓮藥材經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為雪白睡蓮NymphaeacandidaPresl.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；，流動(dòng)相：甲醇-0.5ml/L磷酸(5：95)；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；進(jìn)樣量：10μl。

2.1.2 色譜適用性試驗(yàn) 沒(méi)食子酸理論塔板數(shù) n=5.54(tR/Wh/2)2=7577，說(shuō)明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長(zhǎng)、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測(cè)定效果良好。沒(méi)食子酸分離度 R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) = 4.60，《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定分離度應(yīng)大于1.5，本項(xiàng)結(jié)果表明，分離度符合要求。在上述色譜條件下，藥材中沒(méi)食子酸的色譜峰與其它成分分離度良好。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取睡蓮花藥材(批號(hào)20130108)，粉碎過(guò)40目篩，取0.1g，精密稱(chēng)定，置50ml量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，超聲提取30min，放至室溫，加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1ml含0.196mg的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 沒(méi)食子酸線性關(guān)系考察 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、4ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=30716367.68X-5256.38，r=0.9999，結(jié)果表明，沒(méi)食子酸在0.00196-0.0784mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材(批號(hào)20130108)的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸的RSD為0.73%，表明本方法精密度良好。將上述藥材連續(xù)六天，在相同時(shí)間段取樣處理并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸平均含量為4.16mg/g，RSD為2.62%。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取睡蓮花藥材(批號(hào)20130108)粉末6 份，按所確定的樣品制備方法和色譜條件測(cè)定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸的平均含量為4.18mg/g，RSD為2.13%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材(批號(hào)20130108)的供試品溶液，分別在0、1、3、7、24、32h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸的峰面積RSD為0.72%，表明供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性符合測(cè)試要求。

2.8 回收率測(cè)定 分別精密稱(chēng)取已測(cè)含量的睡蓮花(批號(hào)20130108)粉末6 份，每份約0.05g，分別加入濃度為0.196mg/ml的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1.1ml，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，后按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備進(jìn)行操作，結(jié)果見(jiàn)表1。沒(méi)食子酸平均回收率為98.12%，RSD為1.79%。

2.9 五批樣品的含量測(cè)定 詳見(jiàn)表2。

表1 睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸回收率測(cè)定結(jié)果

表2 五批睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸的含量

3 討論

在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，結(jié)果表明水系統(tǒng)對(duì)沒(méi)食子酸的分離度較差，且峰形不好；進(jìn)而考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈醇-0.2%磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇、乙腈及不同濃度的磷酸水溶液對(duì)睡蓮花樣品中沒(méi)食子酸的分離度和峰形都很好，因此從節(jié)約成本及保護(hù)色譜柱的方面考慮含量測(cè)定采用甲醇-0.05%磷酸水溶液系統(tǒng)。

提取方法的考察中加熱回流法考察了不同提取溶劑、不同提取次數(shù)、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定加熱回流法的最佳提取方法是0.1g藥材加入30ml水，加熱回流兩次每次1.5h。超聲提取法同樣考察不同提取溶劑、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定超聲提取法的最佳提取方法是0.1g藥材加入30ml60%甲醇，超聲0.5h。

綜合樣品穩(wěn)定性以及節(jié)約時(shí)間的考慮，確定睡蓮花中沒(méi)食子酸含測(cè)樣品的制備方法為0.1g藥材加入30ml60%甲醇，超聲0.5h。

本研究采用HPLC測(cè)定了5批次不同產(chǎn)地睡蓮花藥材中沒(méi)食子酸的含量，由于新疆的湖泊數(shù)量和面積較少，加之睡蓮花樣品是未開(kāi)放的花苞，采收的經(jīng)濟(jì)利益較低，所以采集較為困難，故本文收集了五批新疆地產(chǎn)的睡蓮花藥材樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明各產(chǎn)地沒(méi)食子酸含量差異較大，說(shuō)明不同批次的睡蓮花藥材的化學(xué)成分含量有差異，這可能是受氣候、環(huán)境和土壤等因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為維藥睡蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及規(guī)范睡蓮花藥材市場(chǎng)提供了理論依據(jù)。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)[J]．烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：111．

[2]趙軍，徐芳，吉騰飛，等．雪白睡蓮花酚類(lèi)成分研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25(7)： 916-918．

[3]盛萍，帕麗達(dá)·阿不力孜，張烴，等．維吾爾藥睡蓮花中煙花苷的含量測(cè)定[J]．中藥材，2006，12(12)：1313-1314．

[4]趙軍，賀金華，閆明，等．維藥睡蓮花化學(xué)成分研究[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，32(12)：1232-1234．

[5]趙軍，閆明，賀金華，等．維藥睡蓮花中的黃酮醇苷類(lèi)成分分析[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(2)：115-117．

[6]賀金華，趙軍，閆明，等．睡蓮花總酚酸超聲提取工藝研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(10)：2360-2361．

DeterminationofgallicacidcontentofNymphaeaCandida

LI Chen-yang,ZHAO Jun,XU Fang,TAN Wei,CHEN Yan

Xinjiang Institute of Materia Medica，Key Laboratory of Uighur Medicine，Urumqi 830004，China

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：20133318)。

李晨陽(yáng)(1984- )，女，漢，助理研究員，碩士，研究方向：藥物分析、天然藥物化學(xué)。

R284.1

A

1007-8517(2014)24-0006-03

2014.09.29)