骨橋蛋白及其整合素β3受體在肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌中的表達(dá)及意義

龐啟明,李坤

(1.淄博市中心醫(yī)院 兒科,山東 淄博 255000;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

骨橋蛋白及其整合素β3受體在肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌中的表達(dá)及意義

龐啟明1,李坤2

(1.淄博市中心醫(yī)院 兒科,山東 淄博 255000;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

目的 觀察骨橋蛋白及其整合素β3受體在肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌中的表達(dá)變化及其與右心室重塑的關(guān)系，為研究其在心血管病理生理機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。方法 60只SD大鼠分為5組，對(duì)照組和4個(gè)肺動(dòng)脈高壓實(shí)驗(yàn)組（PAH組)，實(shí)驗(yàn)組大鼠通過(guò)皮下注射野百合堿建立肺動(dòng)脈高壓模型，在注射后第1，2，3，4周的4個(gè)時(shí)間取材，命名為PAH1、PAH2、PAH3和PAH4組。測(cè)定各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mPAP)和右心室肥厚指數(shù)；采用免疫組化、Western blot和RT-PCR法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠右心室心肌骨橋蛋白（OPN)及其整合素β3受體mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組大鼠相比，肺動(dòng)脈各高壓組右心室心肌OPN與整合素β3表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，并隨著肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生的時(shí)間延長(zhǎng)而增高。相關(guān)性分析顯示右心室肥厚指數(shù)與右心室心肌0PNmRNA表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)性（r=0.828，P＜0.01)，同時(shí)與右心室心肌整合素β3mRNA也呈明顯正相關(guān)（r=0.822，P＜0.01)。結(jié)論 大鼠肺動(dòng)脈高壓及右室肥大形成過(guò)程中，右心室心肌OPN及其受體整合素β3基因表達(dá)增高，可能在右心室心肌重塑中起重要的作用。

骨橋蛋白；整合素β3；肺動(dòng)脈高壓大鼠模型

心肌骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種糖基化磷蛋白,其作用主要是具有細(xì)胞黏附功能。整合素(integrin)包括α亞基與β亞基,是重要的一類黏附分子,其作用主要為介導(dǎo)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及粘附。而整合素αvβ3主要是經(jīng)識(shí)別并結(jié)合OPN,然后通過(guò)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi),而且它在心血管病理以及生理機(jī)制中也具有重要作用［1-2］。本研究旨在通過(guò)肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌骨橋蛋白及其整合素β3受體基因表達(dá)變化與右心室重塑的關(guān)系,探討肺動(dòng)脈高壓形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選自于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的二級(jí)雄性(SD)大鼠60只(合格證號(hào):410117號(hào)),月齡9個(gè)月,平均體質(zhì)量為(260.15±31.23)g。

1.2 主要試劑 Trizol reagent RNA提取試劑盒、隨機(jī)引物與Taq DNA polymerase購(gòu)自 Promega公司,M-MLV和 RNase inhibitor購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司。野百合堿(Monocrotaline,MCT),購(gòu)自美國(guó)Sigma Chemical Co.公司。引物合成委托北京賽百盛生物有限公司完成。

1.3 動(dòng)物模型的建立 60只健康的雄性SD大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,每組各12只,為4個(gè)肺動(dòng)脈高壓實(shí)驗(yàn)組(PAH組)與1個(gè)對(duì)照組。大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)5～7 d后,以60mg/kg體重給實(shí)驗(yàn)組大鼠皮下注射野百合堿,分別在注射后第1,2,3,4周的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材,命名為PAH1、PAH2、PAH3和PAH4組。對(duì)照組采用皮下注射等量生理鹽水。測(cè)量各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后,將動(dòng)物放血處死,取心肺標(biāo)本,從右心室順著室間隔剪下,同時(shí)將心肺組織置于液氦內(nèi)冷凍待測(cè)。分別稱取左心室加室間隔(LV+S)以及右心室(RV)重量,同時(shí)對(duì)右心室肥厚指數(shù)［Rv/(LV+S)］進(jìn)行計(jì)算。

1.4 骨橋蛋白以及整合素β3 mRNA表達(dá)測(cè)定 總RNA按照Trizol一步法由右心室中提取。20μL反應(yīng)體系,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 其模板為 β-actin mRNA、osteopontin mRNA、integrinβ3 mRNA,設(shè)計(jì)引物如下。

表1 大鼠OPN,integrinβ3及β-actin引物設(shè)計(jì)Tab.1 Rat OPN,integrinβ3 andβ-actin primer design

1.5 免疫組織化法測(cè)定OPN和整合素β3蛋白表達(dá) 取3～5mm由心肺組織蠟塊制成的切片,按以下步驟操作:①常規(guī)酒精梯度脫水與二甲苯脫蠟;②取新鮮H2O230mL封閉內(nèi)源性酶15min;然后進(jìn)行沖洗,沖洗完后給予PBS浸泡5min;③將切片置于pH=8.0的EDTA組織抗原修復(fù)液中,再利用微波加熱修復(fù)10～12min,20min后加一抗于4℃條件下放置過(guò)夜;④第2天復(fù)溫后,加入二抗,室溫條件下孵育30min左右;⑤將辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液加至玻片上,然后在室溫條件下孵育25～30min;⑥在室溫條件下加入DAB試劑顯色5～20min,顯色后用自來(lái)水充分洗滌;⑦再經(jīng)蘇木精復(fù)染后進(jìn)行脫水,二甲苯透明,封片采用中性樹脂。設(shè)置2組,分別為陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組,其中本組所用的陽(yáng)性對(duì)照切片由本院病理科提供,陰性對(duì)照組為PBS代替一抗作。細(xì)胞胞質(zhì)有呈棕黃色的顆粒表示OPN和整合素β3陽(yáng)性表達(dá),采用IBAS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng),400倍光鏡下分別取每張切片的5個(gè)不同視野測(cè)定測(cè)試區(qū)域的灰度值,求得平均值。

1.6 Western blot檢測(cè)OPN和整合素β3蛋白表達(dá)的水平

取各組心肌組織0.1 g加三去污裂解液200μL于冰上裂解30 min后提取總蛋白,常規(guī)進(jìn)行蛋白電泳和膜轉(zhuǎn)入。在進(jìn)行一次抗體反應(yīng)(1∶200,4℃,12 h)后進(jìn)行二次抗體反應(yīng)(1∶1,1 h),再與過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈球菌抗生物素蛋白(1∶1)反應(yīng)1 h。用增強(qiáng)的蛋白反應(yīng)系統(tǒng)探測(cè)免疫反應(yīng)帶。反應(yīng)帶顯色于柯達(dá)膠片后,將膠片置于ES2000掃描儀中掃描并將圖像經(jīng)Power Mac Photoshop6.0軟件轉(zhuǎn)送至NIH-Image 1.62軟件中。使用NIHImage gelmacro工具對(duì)反應(yīng)帶的面積和密度進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算心肌組織OPN和整合素β3蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)的計(jì)算并檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織OPNy與整合素β3mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組大鼠相比,肺動(dòng)脈高壓各組右心室心肌OPN與整合素β3表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖1);且其表達(dá)水平隨著肺動(dòng)脈高壓時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)。

圖1 各組心肌組織OPNy與整合素β3 mRNA水平比較*P＜0.05,與對(duì)照組比較Fig.1 Comparison ofmyocardial tissue OPNy and integrinβ3 mRNA levels in each group*P＜0.05,compared with control group

2.2 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示與PAH4組右心室肥厚指數(shù)與右心室心肌0PN mRNA表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)性(r=0.828,P＜0.01),同時(shí)與右心室心肌整合素β3 mRNA也呈明顯正相關(guān)(r=0.822,P＜0.01)。

2.3 免疫組化檢測(cè)各組右心室心肌組織OPN和整合素β3免疫組化蛋白表達(dá) OPN和整合素β3主要表達(dá)于心肌細(xì)胞胞漿中,在光鏡下呈棕黃色染色。對(duì)照組左、右心室心肌組織OPN和整合素β3表達(dá)水平均很低。肺高壓各組左、右心室心肌OPN和整合素β3表達(dá)水平明顯增高(見圖2、表2),并隨著肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生的時(shí)間延長(zhǎng)而增高。與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

圖2 對(duì)照組和PAH4組右心室心肌OPN和整合素β3免疫組化結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical results of right ventricular OPN and integrinβ3 expression in control group and PAH 4 group

表2 各組右心室心肌組織中OPN和整合素β3表達(dá)比較Tab.2 Comparison of OPN and integrinβ3 expression in right ventricular myocardial tissue in each group

2.3 Western blot檢測(cè)各組OPN和整合素β3蛋白表達(dá)在實(shí)驗(yàn)第4周,PAH4組大鼠右心室心肌組織OPN和整合素β3蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見圖3)。

圖3 OPN和整合素β3蛋白免疫結(jié)果*P＜0.05,與對(duì)照組比較Fig.3 OPN and integrinβ3 protein immunoblotmap*P＜0.05,compared with control group

3 討論

3.1 OPN在心肌重建中的作用 OPN是細(xì)胞外基質(zhì)重要的功能性蛋白質(zhì),有報(bào)道表明,OPN是血管平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記［3］。OPN在心血管系統(tǒng)主要是來(lái)源于巨噬細(xì)胞、VSMC以及EC。而對(duì)于OPN與VSMC、EC兩者之間的作用常見于依賴RGD以及Ca2+抗αVβ3抗體,同時(shí)可使這些細(xì)胞部分阻滯向OPN遷移［4］。故VSMC、EC兩組能夠表達(dá)OPN,同時(shí)具有相互作用。研究結(jié)果顯示［5］,缺乏OPN的大鼠VSMC中有2種細(xì)胞功能改變:VSMC凋亡增加以及VSMC黏附膠原功能缺陷,故而顯示OPN能夠抑制VSMC的凋亡［6］。

OPN能與細(xì)胞表面整合素受體結(jié)合,其中所結(jié)合的整合素中含有α,β2種亞基,并且其組成分為包括胞內(nèi)、細(xì)胞外功能域以及跨膜段。OPN早期主要是經(jīng)焦點(diǎn)粘附激酶(FAK)酪氨酸磷酸化而使其激活,由此可知細(xì)胞遷移過(guò)程中FAK激活具有重要作用。突變分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在介導(dǎo)細(xì)胞遷移過(guò)程中FAK產(chǎn)Tyr397是其關(guān)鍵部位。FAK激活后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括2個(gè)方向,一是經(jīng)Grb2/sos進(jìn)入Ras途徑;二是FAK/Src結(jié)合,進(jìn)入Ras途徑,最終激活絲裂原激活蛋白酶(MAPK)［7］。而激活的 MAPK能夠經(jīng)對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而致使信號(hào)蛋白(主要包括樁蛋白、P130csa)與其它細(xì)胞骨架蛋白等磷酸化,故而起調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的細(xì)胞遷移以及動(dòng)態(tài)組裝功能。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而非單一通路。

3.2 整合素和肺動(dòng)脈高壓以及心肌重建的關(guān)系 粘附是細(xì)胞生長(zhǎng)與損傷修復(fù)一個(gè)重要環(huán)節(jié)。生長(zhǎng)因子(主要包括血管緊張素II)則可促進(jìn)鼠心肌間質(zhì)纖維細(xì)胞ανβ3和β5的mRNA水平的提高。ανβ3能夠與多種含RGD基序的配基(主要包括Fn、Fg、Col)以及血小板反應(yīng)素等結(jié)合,而 βl和 ανβ5則主要分別與Col和Vn結(jié)合［11-14］。故而ECM蛋白與生長(zhǎng)因子(護(hù)腰包括血管緊張素II)共同作用于心肌間質(zhì)纖維細(xì)胞后激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而使細(xì)胞生長(zhǎng)得以促進(jìn),由此可知ECM在心肌重建過(guò)程中具有重要作用［12-13］。

本研究顯示:與對(duì)照組大鼠右心室心肌OPN與整合素β3表達(dá)相比,肺動(dòng)脈高壓各組表達(dá)較對(duì)照組顯著高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肺高壓組左、右心室心肌OPN和整合素β3受體蛋白表達(dá)水平增高,并隨著肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生的時(shí)間延長(zhǎng)而增高。與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相關(guān)性分析顯示與右心室肥厚指數(shù)與右心室心肌0PN mRNA表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)性(r=0.828,P＜0.01),同時(shí)右心室肥厚指數(shù)與右心室心肌整合素β3 mRNA也呈明顯正相關(guān)(r=0.822,P＜0.01)。故肺動(dòng)脈高壓時(shí)右室壓力負(fù)荷的上升致使右心室肥大與心肌細(xì)胞高表達(dá)OPN及其整合素β3可能有關(guān)。然而,OPN如何促進(jìn)細(xì)胞增殖以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是什么尚等進(jìn)一步研究。而適度阻斷OPN的合成,可能為臨床上治療各類心血管疾病所致的血管及心肌重塑提供新的策略。

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(編校:吳茜)

Changes of expressions of osteopontin and integrinβ3 mRNA in right ventricle of pulmonary hypertensive rats

PANG Qi-ming1,LIKun2

(1.Department of Pediatrics,The Central Hospital of Zibo,Shandong 255000,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,The Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences,Shandong 250031,China)

Objective To observe osteopontin and integrin β3 receptor gene expression in cardiac pulmonary hypertension rats and their relationship with right ventricular remodeling.Methods 60 SD were random ly divided into 5 groups,control group and 4 experimental pulmonary hypertension(PAH)goups.Pulmonary hypertension ratsmodelwere constructed by subcutaneous injection ofmonocrotaline,and samples were obtained with 1,2,3,4 weeks after injected,and named as PAH1,PAH2,PAH3 and PAH4 experimental groups.Mean pulmonary arterial pressure(mPAP)and right ventricular hypertrophy index were determined in each groups.The right ventricle myocardial osteopontin(OPN)and integrinβ3 receptormRNA expression levels were detected by immunohistochemistry,western blot and RT-PCR method at different time points in rats in each group.Results Compared with controlgroup,integrinβ3 and OPN expression in each PAH group increased significantly,the differencewere statistically significant(P＜0.05);and their expression were increased with the extension time to produce pulmonary hypertension.Correlation analysis results showed that right ventricular hypertrophy index and right ventricular OPN mRNA expression were positivily correlated(r=0.828,P＜0.01),right ventricular hypertrophy index and integrinβ3 mRNA were also positivily correlated(r=0.822,P＜0.01).Conclusion In the process of pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy formation of rats,OPN and integrinβ3 receptor gene expression increased in the right ventricle myocardial,their expression probably plays an important role in the right ventriclemyocardial remodeling.

osteopontin;integrin β3;ratmodel of pulmonary high pressure

R285.5

A

1005-1678（2014)06-0029-04

山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CL027)；濟(jì)南市科技局科技明星計(jì)劃(20100118)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金(201023)

龐啟明，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：小兒神經(jīng)與遺傳，E-mail： 69704936@qq.com。