性激素通過IL-1/IL-1R通路促進(jìn)原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究

黃坤,周杰Δ,高文濤

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 肝膽外科,廣東 廣州 510515;2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽外科,江蘇 南京 210029)

性激素通過IL-1/IL-1R通路促進(jìn)原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究

黃坤1,周杰1Δ,高文濤2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 肝膽外科,廣東 廣州 510515;2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽外科,江蘇 南京 210029)

目的 探討雌激素E2（estradiol，E2)對原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，及是否通過白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1)/白細(xì)胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R)通路。方法 選取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2013年1月～2014年6月接收的原發(fā)性肝癌男性患者作為觀察組，同期接收的非原發(fā)性肝癌患者為正常對照組。采用ELISA法檢測2組患者血清中的E2、IL-1β和VEGF濃度，Western blot法檢測2組肝組織E2R和IL-1βR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 觀察組患者血清中E2、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)濃度均明顯高于正常對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；觀察組腫瘤組織中E2R和IL-1βR蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。結(jié)論 E2對原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)IL-1/IL-1βR通路，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管的形成。

雌激素；白細(xì)胞介素-1；白細(xì)胞介素-1受體；原發(fā)性肝癌

原發(fā)性肝癌是臨床中較為常見的惡性腫瘤,在世界各國的發(fā)病率都非常高［1］。在我國,原發(fā)性肝癌是臨床發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,在男女人群中有著非常特殊的規(guī)律,男性人群的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于女性人群的發(fā)病率,男女比例達(dá)到7∶1［2］。已有研究表明肝癌的發(fā)生與體內(nèi)激素水平的高低異常有著密切的關(guān)系,肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及肝癌的生物學(xué)特性變化與肝癌組織中性激素受體表達(dá)低下有關(guān),從而導(dǎo)致男性人群中患有原發(fā)性肝癌的機(jī)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于女性人群［3-4］。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要的作用,而癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移又是一個動態(tài)發(fā)展的過程,包括多個環(huán)節(jié),如惡性腫瘤早期的生長、血管在腫瘤中的新生、腫瘤細(xì)胞的脫落、脫落后的腫瘤細(xì)胞入侵到新的基質(zhì)中、在新的組織器官中生長等等［5-6］。在這些極其復(fù)雜的環(huán)節(jié)中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是在多種細(xì)胞因子的調(diào)控下完成的,如白細(xì)胞介素-1(IL-1),近年來研究表明IL-1與肝腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系,IL-1的異常升高可以促進(jìn)原發(fā)性肝癌癥的發(fā)生發(fā)展［7］。

目前尚無文獻(xiàn)報道雌激素是否通過IL-1/IL-1R通路拮抗原發(fā)性肝癌。本研究旨在通過觀察原發(fā)性肝癌患者組織或血清中雌激素及其受體、IL-1β及IL-1βR的表達(dá)水平,來探究性激素是否通過IL-1/IL-1R通路拮抗原發(fā)性肝癌及相應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取2013年1月～2014年6月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院接受手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌患者33例作為觀察組(所用患者均經(jīng)病理證實(shí)),為避免女性患者經(jīng)期體內(nèi)性激素的變化對研究的影響,所有的研究對象均為男性,年齡34～78歲,平均(51.2±4.6)歲,所有患者在研究前均未接受任何的放療和化療;另選取同期本院收治的18例非原發(fā)性肝癌患者(11例為肝外傷患者,7例為肝臟內(nèi)膽管結(jié)石患者)作為正常對照組,其中男性18例,年齡33～75歲,平均(50.3±3.7)歲?；颊呔炇鹆酥橥鈺１緦?shí)驗(yàn)經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會審核通過。所有研究對象均于清晨空腹采集靜脈血,存于-20℃冰箱;采集的觀察組患者的腫瘤組織和正常對照組的正常肝組織存于-80℃冰箱。所用研究對象的排除標(biāo)準(zhǔn):有嚴(yán)重的心腦血管疾病患者;有酒精性肝病和脂肪肝患者;患有原發(fā)性膽汁肝硬化和肝硬化性膽管炎患者;接受抗病毒治療的患者。

1.2 主要試劑與儀器 雌二醇、VEGF、IL-1β酶聯(lián)吸附檢測試劑盒(上海綠葉生物技術(shù)有限公司),雌激素受體(E2R)一抗,白介素-1β(IL-1βR)一抗均為兔抗人(武漢博士德生物工程有限公司),雌激素受體(E2R)二抗,白介素-1β(IL-1βR)二抗為羊抗兔(Chemicon公司),Centrifuge 5417R型離心機(jī)(Eppendorf),酶標(biāo)儀(BioTek SYNERGYTM4),垂直電泳儀(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 血清中E2、VEGF和IL-1β濃度檢測:將采集的靜脈血3500 r/min離心10min,分離得到血清。按照酶聯(lián)吸附檢測試劑盒說明書操作檢測2組患者血清中的雌二醇、VEGF、IL-1β的濃度。

1.3.2 組織中E2R和 IL-1βR蛋白表達(dá)水平的檢測:Western blot檢測2組患者肝組織中E2R和IL-1βR蛋白表達(dá)水平。取患者肝組織,用勻漿器加RIPA勻漿裂解,分離得到組織上清液,和loading buffer(5×)按照4∶1的比例混和煮沸,采用垂直電泳儀電泳,待目的蛋白充分分離后再將目的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜中;轉(zhuǎn)移后在5%脫脂奶粉中封閉2h;PBST反復(fù)洗膜3次,10 min/次;分別加入E2R和IL-1βR一抗(1000×)在4℃冰箱中過夜孵育;PBST反復(fù)洗膜3次,10 m in/次;在二抗(2000×)常溫孵育1 h;在目的蛋白相應(yīng)的位置涂布ECL,在暗室中曝光成像到膠片中;掃描分析目的蛋白的條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 2組血清中E2、VEGF和IL-1β的濃度比較 觀察組患者血清中E2、VEGF和IL-1β濃度均明顯高與正常對照組,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見表1)。表明原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)E2、VEGF、IL-1β合成分泌量均有升高。

表1 2組血清中E2、VEGF、IL-1β濃度比較(pg/mL)Tab.1 Comparison of serum E2,VEGF,IL-1βlevels between two groups(pg/mL)

2.2 2組組織中E2R蛋白表達(dá)水平比較 觀察組中原發(fā)性肝癌患者腫瘤組織中的E2R蛋白表達(dá)量明顯高于正常對照組,2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見圖1)。表明原發(fā)性肝癌患者肝腫瘤組織中的雌二醇受體表達(dá)量增加。

圖1 2組組織中E2R蛋白表達(dá)水平##P＜0.01,與正常對照組比較Fig.1 Expression of E2R Protein in two groups##P＜0.01,compared with control group

2.3 2組組織中IL-1βR蛋白表達(dá)水平比較 觀察組中原發(fā)性肝癌患者腫瘤組織中IL-1β蛋白表達(dá)量顯著高于正常對照組,2組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見圖2)。表明原發(fā)性肝癌患者肝腫瘤組織中的白細(xì)胞介素-1β受體表達(dá)量增加。

圖2 2組組織中E2R蛋白表達(dá)水平##P＜0.01,與正常對照組比較Fig.2 Expression of IL-1βR Protein in two groups##P＜0.01,compared with control group

3 討論

肝癌的發(fā)病率極高,在惡性腫瘤中排第5位。原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展如同其他癌癥是一個極為復(fù)雜的多環(huán)節(jié)過程,其發(fā)病原因多樣,如病毒感染、黃曲霉毒素導(dǎo)致肝臟損傷、酒精導(dǎo)致肝臟損傷、肝硬化、體內(nèi)激素異常［8］。近年來臨床觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌男性患者的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性患者的發(fā)病率,這一結(jié)果逐漸引起人們注意,性激素異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展逐漸成為研究的熱點(diǎn),研究表明體內(nèi)性激素水平的失?？梢砸痼w內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)的異常,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。性激素與存在體內(nèi)的多種亞細(xì)胞器上的相應(yīng)的受體結(jié)合,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理生化過程,包括免疫反應(yīng)、多種細(xì)胞的凋亡和增殖［9］。有研究表明雌激素受體(ER)mRNA在肝癌組織中的表達(dá)陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在正常肝臟組織中的陽性表達(dá)率。ERα與ERβ是雌激素受體(ER)的2個亞型,2者的功能既有共同性又有差異性,ERα可以通過調(diào)節(jié)肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖而影響肝癌患者惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［10-11］。張燕等［4］研究發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤組織中ER mRNA的陽性表達(dá)率顯著高于原來肝癌腫瘤組織的正常肝組織,并且ER mRNA陽性表達(dá)率和肝癌患者的肝腫瘤的分化程度高低、患者性別、肝腫瘤的直徑大小存在密切關(guān)系,特別是在男性患者中ER mRNA的陽性表達(dá)率顯著高于女性患者。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個必不可少的環(huán)節(jié),是一個極其復(fù)雜的過程,涉及到多個環(huán)節(jié),其中腫瘤血管新生和粘附分子的表達(dá)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12-13］。腫瘤血管的形成可以為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新環(huán)境提供生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,并且還可以為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供轉(zhuǎn)移通道,腫瘤血管形成的程度高低已經(jīng)成為評定惡性腫瘤嚴(yán)重程度的一個重要指標(biāo)［14］。IL-1是當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染或產(chǎn)生炎癥時體內(nèi)產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,IL-1產(chǎn)于機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、機(jī)體代謝調(diào)節(jié)等。IL-1有2種亞型,即IL-1α和IL-β,2者雖然基因序列大部分不同,但生物學(xué)功能卻有相似之處。已有研究表明IL-1β可以促進(jìn)腫瘤血管形成,Elena等［15］把含有腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)膠接種到敲除IL-1β基因的小鼠和未敲除IL-1β基因的小鼠的肩胛區(qū),結(jié)果發(fā)現(xiàn)未敲除IL-1β基因小鼠接種的基質(zhì)膠中新生血管的密度顯著高于敲除IL-1β基因的小鼠,并且在未敲除IL-1β基因小鼠接種的基質(zhì)膠中VWF表達(dá)量顯著高于敲除IL-1β基因的小鼠,表明IL-1β可以促進(jìn)腫瘤血管的形成。

本研究結(jié)果顯示:原發(fā)性肝癌患者血清中 E2、IL-1β和VEGF的濃度均顯著高于正常對照組,且肝癌組織中E2R和IL-1β蛋白表達(dá)量也顯著高于正常肝組織。表明E2可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生,其機(jī)制可能是通過上調(diào)IL-1β的分泌量和IL-1β受體放入表達(dá)水平,進(jìn)而上調(diào)肝腫瘤VEGF的表達(dá),促進(jìn)腫瘤血管的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移,最終促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

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(編校:吳茜)

M echanism of primary liver cancer promoted by hormone through IL-1/IL-1R pathway

HUANG Kun1,ZHOU Jie1Δ,GAOWen-tao2

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangdong 510515,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate whether estrogen E2(estradiol,E2)promotes the development of primary liver cancer,as well as the mechanism ofaction is through interleukin-1(interleukin-1,IL-1)/IL 1 receptor(interleukin-1 receptor,IL-1R)pathway.Methods Male patientswith primary liver cancer were selected as the observation group of our hospital from January 2013 to June 2014.The same period of non-primary liver cancer patientswere selected as normal control group,the patientswere detected by ELISA,and serum E2,IL-1βand VEGF concentrationswere detected by Western blot in liver tumor tissue and normal liver tissue and IL-1βR E2R protein levels.Results Serum in E2,IL-1β,and vascular endothelial in observation group(vascular endothelial growth factor,VEGF)were significantly higher than the normal control group,and between the two groupswas significant difference(P＜0.01);expressions of E2R and IL-1βR in tumor tissue of obsenvation group were significantly higher than the normal control group,and between the two groups was significant difference(P＜0.01).Conclusion The development of E2 to promote the role of primary liver cancer,and themechanism of actionmay be changed by upregulating IL-1/IL-1βR pathway promotes the expression of VEGF,causing the formation of tumor blood vessels and completed.

estrogen;interleukin-1;interleukin-1 receptor;primary liver cancer

TQ460.7

A

1005-1678（2014)06-0021-03

國家自然科學(xué)基金(81172267)

黃坤，男，博士，研究方向：肝膽胰疾病，E-mail：1013532486@qq.com；周杰，通信作者，男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰疾病及肝移植，E-mail：jacky@fimmu.com。