靶向抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的抗腫瘤藥物研究

錢晨 彭再利 巢暉

(中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 廣東廣州510275)

無論在原核或真核細(xì)胞中，天然狀態(tài)的DNA都主要以超螺旋的形式存在。在DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及基因表達(dá)過程中，DNA雙螺旋鏈需要在超螺旋狀態(tài)與解旋狀態(tài)之間不斷進行轉(zhuǎn)換。為了解決DNA在代謝過程中出現(xiàn)的構(gòu)象問題，生物在長期進化的過程中演化出了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase，Topo)，可通過催化作用改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞不同，拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出不受其他因素影響的高水平表達(dá)。因此抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性就能阻止腫瘤細(xì)胞快速增殖，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡及壞死。近年來，以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點設(shè)計各類抑制劑，用作抗癌藥物的研究已成為腫瘤化療的重要途徑。本文將對拓?fù)洚悩?gòu)酶的結(jié)構(gòu)、功能及以其為靶點的抗腫瘤藥物研究進展進行介紹。

1 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的結(jié)構(gòu)與功能

拓?fù)洚悩?gòu)酶是通過兩個連續(xù)的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)重復(fù)斷開和連接DNA主鏈的磷酸二酯鍵來催化DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，進而直接參與或影響細(xì)胞DNA的復(fù)制、翻譯、轉(zhuǎn)錄、重組以及有絲分裂等生命過程［2］。根據(jù)拓?fù)洚悩?gòu)酶催化機制的不同，主要將其分為兩類:TypeⅠ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶與 TypeⅡ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶［3］。TypeⅠ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶屬于單體酶，包括TopoⅠA、TopoⅠB和TopoⅠC 3種亞型，它在作用過程中不需要額外能量因子。TypeⅡ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶是同源二聚體酶，包括TopoⅡα、TopoⅡβ兩種亞型［4］。在人細(xì)胞中，主要包含DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)兩種，分別歸類于TopoⅠB和 TopoⅡα。

1.1 TopoⅠ的結(jié)構(gòu)與功能

TopoⅠ最早是1971年在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，人類TopoⅠ是哺乳動物TopoⅠ的原始型，相對分子質(zhì)量為100 000，位于染色體20q12～13.2單拷貝基因編碼上。TopoⅠ是一種單體酶(圖1a)，由756個氨基酸殘基組成，其中起催化作用的酪氨酸(Tyr)位于羧基端。TopoⅠ在DNA雙鏈上產(chǎn)生單鏈斷裂，使另一單鏈從缺口處穿過，改變DNA超螺旋或螺旋化不足的情況。TopoⅠ中的Tyr與DNA 3'斷端的磷酸鹽以共價鍵結(jié)合，同時在斷裂缺口的5'位形成羥基末端(圖1b)，5'羥基末端繞另一完整的DNA鏈旋轉(zhuǎn)，此過程具有可逆性，不需要ATP和二價金屬陽離子的參與。這種結(jié)構(gòu)上的特性使TopoⅠ對正超螺旋和負(fù)超螺旋DNA具有幾乎相同的松弛能力［5］。

圖1 TopoⅠ酶的結(jié)構(gòu)(a)及TopoⅠ酶與DNA的結(jié)合位點示意圖(b)

TopoⅠ催化單鏈斷裂和連接的過程如圖2［2］所示:第一步，酶識別結(jié)合到特異DNA序列上;第二步，切開單鏈，酶通過磷酸二酯鍵與DNA共價結(jié)合形成可斷裂復(fù)合物;第三步，酶在斷裂單鏈上的過渡;第四步，在切開位點上對斷裂單鏈進行重連;第五步，繼續(xù)解旋，重復(fù)應(yīng)用活化后的可斷裂復(fù)合物;第六步，解旋之后，酶從DNA上釋放出來［6］。

圖2 TopoⅠ作用機理圖

1.2 TopoⅡ的結(jié)構(gòu)與功能

TopoⅡ最早發(fā)現(xiàn)于1980年，人類TopoⅡ也是哺乳動物TopoⅡ的原始型，位于人染色體17q21～22單拷貝基因編碼的二聚體蛋白上，表達(dá)依賴于細(xì)胞周期。TopoⅡ是由兩個相同亞基組成的二聚體(圖3a)。TopoⅡ在DNA主鏈上產(chǎn)生雙鏈斷裂，使另一條雙鏈DNA從缺口處穿過，在整個過程中需要ATP提供能量。除了能完成所有TopoⅠ的功能以外，TopoⅡ還能在DNA復(fù)制完成后分開相互交聯(lián)的姐妹染色單體。TopoⅡ能對特殊的DNA序列進行識別，并通過Tyr與DNA 5'斷端的磷酸基以共價鍵結(jié)合(圖3b)［5］，形成易解離復(fù)合物，改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，然后再催化斷裂鏈的重新連接［7］。

圖3 TopoⅡ酶的結(jié)構(gòu)(a)及TopoⅡ酶與DNA的結(jié)合位點示意圖(b)

TopoⅡ可以剪切和打開一股雙螺旋鏈，其催化過程如圖4［2］所示:第一步，酶識別結(jié)合到特異DNA序列上;第二步，切開雙鏈，酶與DNA斷裂后產(chǎn)生的5'端結(jié)合，形成酶-DNA共價復(fù)合物;第三步，另一完整的雙鏈DNA穿過主鏈切開的位點，此過程需結(jié)合ATP;第四步，在切開位點上對雙鏈進行重連;第五步，與酶結(jié)合的ATP酶水解;第六步，酶周轉(zhuǎn)，回到能重新啟動催化反應(yīng)的狀態(tài)［8］。

圖4 TopoⅡ作用機理圖

2 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑作為抗腫瘤藥物的研究

從細(xì)菌到人類，拓?fù)洚悩?gòu)酶廣泛存在于各種生物體的細(xì)胞中。與正常細(xì)胞不同的是，拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤細(xì)胞中均表現(xiàn)出不受其他因素影響的高水平表達(dá)，盡管原因尚不清楚，但這卻是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑對腫瘤細(xì)胞具有特殊療效的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)許多抗腫瘤藥都是通過拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮療效的。因此，以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶分子設(shè)計各種抑制劑，并使其成為抗腫瘤藥物，已成為腫瘤化療研究新熱點。

2.1 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的作用機理

現(xiàn)今研究業(yè)已證實，可通過影響Topo酶作用過程的各個階段來破壞酶的活性。既可以直接作用于DNA，也可以作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶，還可以作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA斷裂復(fù)合物，來完成對拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。抑制劑的作用實際上是使細(xì)胞內(nèi)功能正常的拓?fù)洚悩?gòu)酶轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)致DNA鏈斷裂的致傷物，而細(xì)胞死亡的最終原因可能是由于DNA鏈斷裂的錯誤修復(fù)或是由于可斷裂復(fù)合物的形成及穩(wěn)定存在，激活了細(xì)胞內(nèi)一系列導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡的過程。

大體上來說，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的抑制機理可以分為兩種，一種是毒性機理，一種是催化抑制機理。

毒性機理是指抑制劑與Topo-DNA共價復(fù)合物形成三元復(fù)合物。通過提高Topo-DNA共價復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)濃度使Topo酶“中毒”。具體地說，在正常情況下，拓?fù)洚悩?gòu)酶能使DNA發(fā)生瞬間斷裂和重接，但是在藥物作用下，TopoⅠ或TopoⅡ在切開單鏈或雙鏈后，拓?fù)洚悩?gòu)酶與末端DNA以共價鍵形成一種易解離的復(fù)合物(酶-DNA可斷裂復(fù)合物)(圖5)［3］，并使這一可逆的平衡反應(yīng)趨向于酶-DNA可斷裂復(fù)合物一側(cè)，從而導(dǎo)致DNA鏈的斷裂，并進一步啟動一系列導(dǎo)致細(xì)胞死亡的因素。

圖5 TopoⅠ/TopoⅡ在拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑作用下與DNA形成可斷裂復(fù)合物

與毒性機理不同，催化機理是指抑制劑通過阻滯Topo的某一特定功能或催化反應(yīng)中的某一步驟，進而抑制Topo總的催化活性。Topo催化抑制劑主要是一些DNA或蛋白酶的結(jié)合劑，包括插入劑如阿克拉霉素A和大小溝結(jié)合劑如Hoechst33258等，Topo催化抑制劑可以作用在拓?fù)洚悩?gòu)酶催化反應(yīng)的各步驟，因此其作用機制也不相同。大致可分為3類:①抑制Topo與DNA的結(jié)合，通過阻斷酶與其底物DNA的接觸，化合物可以削弱酶在催化和構(gòu)象上的功能，如阿柔比星。②穩(wěn)定Topo-DNA共價復(fù)合物，抑制Topo的催化功能，如ICRF-187。③ 阻止ATP鍵合(僅TopoⅡ)，如新生霉素［10］。

2.2 有機小分子作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的研究進展

目前對于DNA拓?fù)涿敢种苿┑难芯看蟛糠旨性谝恍┥飰A類有機化合物。根據(jù)其作用的底物不同，Topo酶抑制劑可以分為TopoⅠ、TopoⅡ抑制劑和TopoⅠ/Ⅱ雙重抑制劑。

以TopoⅠ為靶點的抗腫瘤藥物主要是喜樹堿及其衍生物［11］。喜樹堿(camptothecin，CPT)類化合物是從琪桐科植物喜樹中分離得到的生物堿，具有較強的細(xì)胞毒性，對肺癌、胃癌、腸癌、卵巢癌、膀胱癌及白血病等均有較好療效;但由于CPT內(nèi)酯環(huán)在生理條件下的不穩(wěn)定性(圖6)及其毒副作用，此類抑制劑的研究重點主要集中在通過對母體CPT的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行改造，尋求更好的CPT衍生物。目前已有3種CTP類藥物在國內(nèi)外上市，在臨床上用于結(jié)腸癌、卵巢癌和肺癌等的治療;還有30多個CPT衍生物正處于臨床試驗階段。另外，尋找水溶性更好、細(xì)胞毒性更強的CPT衍生物的研究也在持續(xù)進行［12-13］。CPT類化合物的作用機制是在TopoⅠ作用過程中與DNA形成可斷裂復(fù)合物，阻礙DNA鏈的閉合，導(dǎo)致細(xì)胞DNA單鏈斷裂的累積。這種單鏈斷裂對細(xì)胞來說并不是致死性的，當(dāng)可斷裂復(fù)合物與正在進行復(fù)制的DNA復(fù)制叉相遇時，會繼發(fā)地造成不可逆的DNA雙鏈斷裂，最終引起細(xì)胞死亡(圖7)［3］。

圖6 CPT在生理條件下的不穩(wěn)定性

圖7 CPT類TopoⅠ抑制劑的作用機制

CPT類抑制劑和TopoⅠ-DNA形成的三元復(fù)合物在藥物濃度降低以后，會很快被逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白將CPT類化合物轉(zhuǎn)運出細(xì)胞從而產(chǎn)生耐藥性。因此，增強CPT-TopoⅠ-DNA三元復(fù)合物的穩(wěn)定性對此類化合物藥效的發(fā)揮有著重要意義。支志明等［14］通過分子動力學(xué)研究，提出了預(yù)測三元復(fù)合物穩(wěn)定性的方法，并總結(jié)了具有穩(wěn)定作用的CPT衍生物的結(jié)構(gòu)特征。

以TopoⅡ為靶點的抗腫瘤藥物較多，根據(jù)與底物的作用方式不同，將TopoⅡ抑制劑分為TopoⅡ毒劑和TopoⅡ催化抑制劑。毒性機理是指抑制劑與TopoⅡ-DNA形成三元復(fù)合物，通過提高復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)濃度使Topo酶“中毒”，受藥細(xì)胞基因組DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂并累積，從而導(dǎo)致細(xì)胞變異或死亡。迄今發(fā)現(xiàn)的TopoⅡ抑制劑大部分為TopoⅡ毒劑，常見的有阿霉素 (Doxorubicin)，VP-16(Etoposide)，沙爾威辛等。與毒性機理不同，催化抑制機理是指抑制劑通過阻滯TopoⅡ的某一功能或催化反應(yīng)中的某一特定步驟，進而抑制TopoⅡ總的催化活性。此類藥物包括:新生霉素(Novobiocin)、美巴龍(Merbarone)、阿柔比星(Aclarubuxin)、ICRF-193 等［15］(圖8)。

研究表明，處于S期的細(xì)胞TopoⅡ的含量比較高。TopoⅡ毒劑主要在S期對DNA產(chǎn)生不可逆的雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致DNA斷裂復(fù)合物在G2期的積累。TopoⅡ催化抑制劑(如阿柔比星)也主要作用于S期，使超螺旋DNA的松弛在DNA復(fù)制前減慢，影響G1期到S期的進程，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期在G2期停滯［16］。吖啶類化合物作為抗菌、抗癌藥物的研究取得了很大進展，而其抗癌作用的原理就在于抑制了TopoⅡ這一關(guān)鍵酶。John R.Goodell等［17］通過研究一系列吖啶類化合物對細(xì)胞周期的影響，對該系列化合物作為TopoⅡ抑制劑的抑制機理作出了區(qū)分(圖9)。

圖8 一些常見的TopoⅡ抑制劑

現(xiàn)今，人們在研究以TopoⅠ或TopoⅡ為靶點的抗癌藥物方面有了長足的進步，然而以單一拓?fù)涿笧榘悬c的抗癌藥物卻存在著很多缺陷。有研究證明，由TopoⅡ抑制劑造成的DNA雙鏈斷裂會導(dǎo)致二次惡性腫瘤的發(fā)生［18］;另外，選擇性地抑制TopoⅠ會引起體內(nèi)TopoⅡ含量上升;并且，TopoⅠ和TopoⅡ抑制劑聯(lián)合用藥會引起嚴(yán)重的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性，甚至?xí)箖煞N抑制劑之間發(fā)生競爭性抑制，從而降低兩種抑制劑各自的藥效［19］。TopoⅠ和TopoⅡ雙重抑制劑對TopoⅠ和TopoⅡ都有抑制效果，有望解決單一的拓?fù)涿敢种苿┰诠┧幠褪苄陨系膯栴}，而且它們可以完全抑制DNA、RNA的合成，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于它們的抑制能力一般都比較強，可以減小供藥濃度太大所引起的毒性問題。

圖9 吖啶類TopoⅡ毒劑和TopoⅡ催化抑制劑

大部分TopoⅠ/TopoⅡ雙重抑制劑是TopoⅠ和TopoⅡ的雙重毒劑，能同時穩(wěn)定兩種拓?fù)涿概cDNA形成的可斷裂復(fù)合物，從而抑制拓?fù)涿傅幕钚?。例如近幾年發(fā)現(xiàn)的吩嗪類衍生物XR11576，研究證明它能同時介導(dǎo)TopoⅠ/TopoⅡ-DNA可斷裂復(fù)合物的形成，是TopoⅠ和TopoⅡ的雙重毒劑，并且這種藥物對過量表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞有很好的殺傷效果，現(xiàn)已進入臨床前試驗階段。另一種研究比較透徹的TopoⅠ/TopoⅡ雙重毒劑茚托利(intoplicine)的作用方式稍有不同，它是通過deep intercalation mode和outside binding mode兩種模式分別穩(wěn)定了TopoⅠ及TopoⅡ與DNA形成的可斷裂復(fù)合物［20］。

近些年來，TopoⅠ/TopoⅡ雙重抑制劑引發(fā)了人們?nèi)找鏉夂竦呐d趣，一系列不同結(jié)構(gòu)、不同作用機制的雙重抑制劑被合成了出來，包括靈菌紅素(Prodigiosin)，姜黃素(Curcumin)，吲哚基喹啉衍生物TAS-103等(圖10)，其中PZA和茚托利辛已進入臨床一期試驗階段［21］。然而，目前關(guān)于這些化合物的構(gòu)效關(guān)系以及具體作用機理的研究仍不透徹，這大大制約了這類化合物的應(yīng)用。至今仍無TopoⅠ/TopoⅡ類雙重抑制劑抗癌藥物進入市場。

圖10 常見的TopoⅠ/TopoⅡ雙重抑制劑

2.3 金屬配合物作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的研究進展

目前對于DNA拓?fù)涿敢种苿┑难芯恐饕性谝恍┥飰A類有機化合物，金屬配合物抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的研究還較少有人涉及。有機類拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、特異性不高、溶解性差、毒性較大等缺點。與有機化合物相比，金屬配合物分子結(jié)構(gòu)具有更好的可塑性，容易在配體上引入其他分子活性基團，可以針對不同的底物結(jié)合環(huán)境進行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)修飾;而且其豐富的光電磁性質(zhì)將有助于探索某些復(fù)雜的生命過程。

自從20世紀(jì)80年代，Barton等在研究金屬配合物與DNA作用時發(fā)現(xiàn)Zn2+，Co3+，Ru2+等配位飽和的八面體手性配合物具有識別DNA二級結(jié)構(gòu)的能力，金屬配合物與DNA的識別和結(jié)合已成為近年來生物無機化學(xué)領(lǐng)域較活躍的研究課題之一。雖然發(fā)現(xiàn)不少金屬配合物具有識別和斷裂DNA功能，但真正在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制方面的具體應(yīng)用還非常少，至今僅有為數(shù)不多的關(guān)于金屬配合物抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的研究報道，主要集中在鉑類、釕類、金類等金屬配合物方面。

2.3.1 鉑類配合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑

鉑類配合物作為研究最早的抗腫瘤藥物，一直備受研究者關(guān)注。2004年，J.H.M.Schellens等研究發(fā)現(xiàn)由于順鉑與DNA堿基共價結(jié)合，當(dāng)與喜樹堿聯(lián)合應(yīng)用時，喜樹堿的TopoⅠ抑制活性明顯增強［22］。A.H.J.Wang課題組報道了一系列含tpy平面配體的鉑配合物［23］，該系列鉑配合物是一類有效的TopoⅠ/Ⅱ 雙重抑制劑，對TopoⅠ/Ⅱ抑制IC50分別達(dá)到了10μmol/L與5μmol/L(圖11a)。支志明課題組最近也報道了一系列含修飾tpy配體的鉑配合物(圖11b)［24-25］，實驗顯示，該系列鉑配合物是TopoⅡ抑制劑;經(jīng)過修飾之后的鉑配合物，對TopoⅡ抑制活性明顯提高。鉑配合物是通過穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA二元復(fù)合物來達(dá)到抑制效果的，是典型的TopoⅡ毒劑。

圖11 鉑配合物拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑結(jié)構(gòu)式

2.3.2 釕類配合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑

釕多吡啶配合物具有既為剛性又帶手性的八面體構(gòu)型，水溶性比較好，熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易發(fā)生配體取代，易于在近生理條件下開展研究，光化學(xué)、光物理信息豐富，毒性低，細(xì)胞膜透性較好。1999年，A.K.Kondapi報道配合物［RuCl2(C6H6)(dmso)］可以作為TopoⅡ毒劑，用于抑制腫瘤增殖［26］。而后，他們將DMSO換成嘧啶及嘧啶類衍生物，發(fā)現(xiàn)它們具有更好的TopoⅡ毒性，并對乳腺癌和結(jié)腸癌表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性［27］。此后，關(guān)于以Topo為靶點的釕配合物的報道并不多。我們課題組長期致力于釕配合物抗腫瘤活性的研究。近年來，我們設(shè)計合成了一系列具有剛性平面配體的釕多吡啶配合物，并對其抗腫瘤作用機理進行了系統(tǒng)的研究。2007年，我們首次報道了具有TopoⅡ抑制效果的一對手性配合物 Λ-［Ru(bpy)2(uip)］2+和 Δ-［Ru(bpy)2(uip)］2+(圖12a)［28］，結(jié)果顯示，它們對 TopoⅡ具有很強的抑制活性，IC50分別為3μmol/L與5μmol/L。通過抑制機理試驗，我們發(fā)現(xiàn)這一對手性配合物為TopoⅡ毒劑，可以穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA斷裂復(fù)合物，并且與傳統(tǒng)的TopoⅡ毒劑依托泊苷、玫瑰樹堿一樣，它們可以直接作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶。體外毒性結(jié)果顯示，配合物對人白血病細(xì)胞株、人肝癌細(xì)胞株、人宮頸癌細(xì)胞株、人鼻咽癌細(xì)胞株也表現(xiàn)了良好的抗癌活性。通過引入鳥嘌呤結(jié)構(gòu)，合成了具有特異識別G-C堿基的釕(Ⅱ)多吡啶配合物［Ru(bpy)2(appo)］2+。抑酶活性測定證實該配合物表現(xiàn)出很高的TopoⅡ抑制能力(IC50＜1μmol/L)［29］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，配合物對拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制活性與釕配合物輔助配體有一定關(guān)系［30］。最近，我們又相繼報道了4個具有良好TopoⅠ/Ⅱ雙抑制活性的釕多吡啶配合物［Ru(bpy)2(bfipH)］2+、［Ru(phen)2(bfipH)］2+(圖12b)、Λ/Δ-［Ru(bpy)2(ipad)］2+(圖12c)［31-32］，該類配合物對 TopoⅠ/Ⅱ均具有良好的抑制活性，是TopoⅠ/Ⅱ的雙重毒劑。細(xì)胞毒性實驗顯示，配合物對人宮頸癌細(xì)胞株、人肝癌細(xì)胞株、人乳腺癌細(xì)胞株等有較好的抑制活性。通過細(xì)胞實時分析、單細(xì)胞凝膠電泳、AO/EB雙染實驗和流式細(xì)胞術(shù)等實驗，證明配合物可以造成細(xì)胞DNA損傷，進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前釕類配合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的抗腫瘤活性研究僅限于體外研究階段，需要更進一步對其作用機理等進行詳細(xì)的研究，以確定其作為抗腫瘤藥物的臨床可能性。

圖12 釕配合物拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑結(jié)構(gòu)式

2.3.3 其他金屬配合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑

除了鉑、釕類金屬配合物以外，常見的已用于抗腫瘤藥物研究的還有金、鎘、鈷、鎳等金屬配合物，但是關(guān)于它們作為拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制劑的報道則很少。

支志明課題組最近首次報道了4個單核與雙核金配合物，配合物包含一個三聯(lián)吡啶配體，與金原子形成共平面。研究結(jié)果顯示，該類配合物是TopoⅠ抑制劑，在小鼠體內(nèi)顯示了很好的腫瘤抑制活性［33］。之后，A.Desideri課題組詳細(xì)研究了金配合物的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制機理。研究發(fā)現(xiàn)，金配合物與喜樹堿類抑制機理完全不同，它是通過直接抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來抑制整個催化過程［34］。

此外，S.K.Singh等發(fā)現(xiàn)一系列有水溶性的芳烴金屬銠配合物有很好的 TopoⅡ抑制作用［35］，D.Jayaraju等研究了一系列鈷水楊醛肟類配合物，發(fā)現(xiàn)它們是一類很好的DNA插入試劑和TopoⅡ毒劑，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［36］。近年來，又陸續(xù)有一些Cd2+、Ni2+［37-38］金屬配合物作為TopoⅡ抑制劑的報道。目前，金屬配合物抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的研究還處于起步階段，有關(guān)配合物結(jié)構(gòu)、DNA作用方式及拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制功能間相互關(guān)系等方面的研究工作都急待開展。

3 結(jié)語

拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、重組和修復(fù)中起著十分重要的作用，現(xiàn)已成為抗腫瘤治療的一種新靶點。從20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)至今，經(jīng)過幾十年的努力，人們已經(jīng)研制出一系列的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑作為有效的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，并對其作用機理做了大量研究。但是抑制劑殺傷癌細(xì)胞的機理十分復(fù)雜，癌細(xì)胞的最終死亡很可能是多種調(diào)控蛋白復(fù)制叉協(xié)同作用的綜合結(jié)果，而抑制所完成的僅是全部過程中的一個必要起始步驟。人們對這一系列的過程仍需進行更深入的研究。另外，作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，金屬配合物有其獨特的優(yōu)勢，雖然迄今這方面的研究還很少，但有望會在不久的將來成為一個研究熱點。

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