王濤 王鵬 董麗
沙眼衣原體(CT)、解脲脲原體(Uu)及淋球菌(NG)是性病的主要病原體。近年研究表明,采用常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物,再采用膜雜交技術(shù)鑒定擴增產(chǎn)物,可保持雜交特異性,診斷正確率高[1-3]。本研究對1486例疑為泌尿生殖道感染的患者采用PCR反向膜雜交法篩查,現(xiàn)報道如下。
1.1 一般資料 1486例為2013年1月-2014年6月到本院治療的疑似泌尿生殖道感染患者,大部分患者存在外陰搔癢、不適等癥狀,已將1個月內(nèi)使用過抗支原體、衣原體藥物者剔除。其中男634例,女852例;年齡17~60歲,平均(33.6±5.7)歲。
1.2 檢測方法
1.2.1 儀器與試劑 人乳頭狀瘤病毒分型檢測試劑盒(深圳生化有限責任公司生產(chǎn));MJopticon2型FQPCR擴增分析儀及其配套試劑(美國生產(chǎn));CT快速檢測卡,UU、NG培養(yǎng)基(潮州凱普生物化學有限公司生產(chǎn))。
1.2.2 標本采集 男性標本:將消毒棉拭子伸入受檢者尿道口中1~2 cm,旋轉(zhuǎn)10 s取分泌物。女性標本:將消毒棉拭子插入宮頸1~2 cm處,旋轉(zhuǎn)20 s取上皮細胞。男、女各取3份分泌物標本。
將其中兩份置入1 mL無菌生理鹽水試管中,加入2 mL漂洗液放入離心機中進行12 000 r/min離心處理15 min,隨后在離心沉淀中滴入50 μL DNA提取液,搖勻后放入100 ℃沸水中浸浴15 min;隨后再進行15 000 r/min離心處理10 min,取5 μL上清液進行擴增處理[4]。
另1份標本置入培養(yǎng)基中培養(yǎng),CT采用Hela-229及McCoy細胞培養(yǎng),培養(yǎng)24 h;將UU培養(yǎng)基放入37 ℃左右的溫箱中培養(yǎng),48 h后觀察標本顏色;NG接種于巧克力平板,置于37 ℃溫箱培養(yǎng),加入5%CO2,培養(yǎng) 24 h[5]。
1.2.3 PCR擴增反應 取處理好的上清液進行PCR擴增反應,均嚴格按照說明書要求操作。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照。
1.2.4 膜雜交反應 (1)DNA變性:將20 μL DNA變形液加入擴增后的上清液中,搖勻放置2 min充分反應。(2)雜交:在酶板條第一排孔中加入40 mL雜交緩沖溶液A,按順序滴入10 μL變性DNA液,搖勻后插入對應雜交膜,于37 ℃恒溫箱中放置5~10 min。(3)洗膜:在酶板條第二排孔中滴入1滴雜交緩沖液B,將之前制成的雜交梳按序號置入,放入37 ℃恒溫箱中7~10 min。(4)酶結(jié)合:在酶板條第三排孔中滴入1滴SA-AP,按順序?qū)⑶懊娴诙烹s交梳插入對應孔中,放入25 ℃恒溫箱中7~10 min。(5)顯色:在酶板條第四排孔中分別滴入1滴顯色物液 A和顯色物底物液B,混勻后將之前第三排雜交梳插入對應孔中,放入25 ℃恒溫箱中5~10 min[6]。
1.2.5 FQ-PCR擴增反應 取1份離心處理后的上清液,按照試劑盒的操作要求置入反應管中,上機進行FQ-PCR擴增反應。反應條件為:93 ℃ 2 min預變性;93 ℃ 45 s,55 ℃ 1 min,10 個循環(huán);93 ℃ 30 s,55 ℃45 s,30個循環(huán)[7]。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照,以試劑盒中給出的DNA濃度作標準曲線,以此標準定量法測定。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學分析,計數(shù)資料采用 字2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 檢測結(jié)果 1486例患者中,培養(yǎng)法檢測出947例(63.73%)陽性,539例(36.27%)CT、UU、NG全陰性。FQ-PCR陽性率為70.25%,與培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計學意義( 字2=14.31,P<0.01);PCR反向膜雜交法陽性率為66.96%,與培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學意義(字2=3.42,P>0.05)。FQ-PCR、PCR反向膜雜交法陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(字2=3.75,P>0.05)。見表1。
2.2 檢測敏感性及特異性 以培養(yǎng)法檢測結(jié)果作為金標準,F(xiàn)Q-PCR、PCR反向膜雜交法檢測的敏感性均為100%;FQ-PCR檢測的特異性為82.00%,PCR反向膜雜交法為91.09%,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(字2=19.13,P<0.01)。見表 2。
表1 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測CT、UU、NG陽性率比較 例(%)
表2 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測敏感性及特異性 例(%)
CT、UU及NG是性傳播疾病的主要病原體。然而,這3種病原體感染癥狀不典型,部分患者甚至無任何癥狀,這給病原學診斷帶來挑戰(zhàn)。本文嘗試采用PCR反向膜雜交法篩查CT、UU及NG三種性病[8]。
培養(yǎng)法是性病病原體檢測的常規(guī)方法,但其培養(yǎng)時間較長,一般需要2~3 d才能獲得檢測結(jié)果,同時其對檢測設備及操作要求較高[9-10]。FQ-PCR法以其簡便、微量、快速等優(yōu)勢而成為CT、UU、NG三種性病篩查的首選方法。FQ-PCR其是在原有PCR技術(shù)的基礎上,將熒光能量傳遞技術(shù)融合進來,通過電腦控制檢測實現(xiàn)了對擴增病原體的實時動態(tài)觀察,可較準確地反映病原體感染情況[11]。然而,F(xiàn)Q-PCR探針無法保持雜交特異性,在檢測中易產(chǎn)生非特異性及假陽性產(chǎn)物,使假陽性偏高。
隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,膜雜交技術(shù)逐漸應用于性病篩查中。PCR反向膜雜交技術(shù)應用DNA探針、核酸雜交,酶聯(lián)顯色等多種技術(shù)進行CT、UU、NG三種性病病原學檢測[12]。其利用PCR技術(shù)擴增產(chǎn)物,隨后采用核酸雜交、酶聯(lián)顯色對擴增產(chǎn)物進行鑒定,檢測準確性高[13]。本組中,PCR反向膜雜交法檢測陽性率略低于FQ-PCR,但兩組差異比較無統(tǒng)計學意義。由此可知,PCR反向膜雜交法檢與FQ-PCR有著同樣準確檢測優(yōu)勢。PCR反向膜雜交法中的擴增產(chǎn)物用生物素標記后,其固定在膜條上的特異性探針進行反向膜雜交,探針捕獲的生物素標記和流動相中的靶序列特異性結(jié)合,酶催化底物顯色,并在膜上顯出藍色斑點[14]。膜雜交技術(shù)需要在固相載體膜上交聯(lián)特異性探針能夠很好的保持雜交的特異性,同時在試劑盒中加入duTP和UDCT酶等可消除擴增產(chǎn)物被污染對結(jié)果的干擾,可克服FQ-PCR的缺點[15]。本組中,PCR反向膜雜交法與FQ-PCR檢測的敏感性均為100%,證實兩種方法均可作為CT、UU、NG三種性病篩查的敏感性方法。但PCR反向膜雜交法檢測特異性顯著高于FQ-PCR(P<0.01)。由此可知,PCR反向膜雜交法可避免FQ-PCR檢測所具有的假陽性偏高的缺點。
綜上所述,PCR反向膜雜交法篩查CT、UU、NG準確,快速,且篩查特異性高于FQ-PCR,值得臨床推廣適用。
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