調(diào)氣行水合劑對(duì)肝癌腹水小鼠模型細(xì)胞凋亡基因的影響

楊志新，尤建良，浦瓊?cè)A

（無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 無(wú)錫 241071）

調(diào)氣行水合劑對(duì)肝癌腹水小鼠模型細(xì)胞凋亡基因的影響

楊志新，尤建良Δ，浦瓊?cè)A

（無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 無(wú)錫 241071）

目的研究調(diào)氣行水合劑結(jié)合順鉑、白介素-2腹腔注射對(duì)肝癌腹水小鼠模型細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase-3、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)水平揭示其治療肝癌腹水的機(jī)制。方法將72只純系昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、純中藥組、中西醫(yī)結(jié)合大、中、小劑量組及西藥組，每組12只。用藥結(jié)束后，處死小鼠，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)小鼠肝腫瘤組織Bax、Caspase-3、TGF-β1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果通過圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像面積及積分光密度進(jìn)行測(cè)算，中西醫(yī)結(jié)合大劑量組細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。中西醫(yī)結(jié)合大、中劑量組細(xì)胞凋亡基因Caspase-3、TGF-β1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論中西醫(yī)結(jié)合大劑量組可明顯增加細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白表達(dá)，中西醫(yī)結(jié)合大、中劑量組可明顯增加細(xì)胞凋亡基因Caspase-3、TGF-β1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。揭示了調(diào)氣行水合劑聯(lián)合順鉑、白介素-2腹腔注射治療肝癌腹水的作用機(jī)制。

肝癌腹水；調(diào)氣行水合劑；Bax；Caspase-3；TGF-β1；細(xì)胞凋亡

調(diào)氣行水合劑為經(jīng)方小柴胡湯與五苓散合方化裁而來(lái)，為江蘇省無(wú)錫市名中醫(yī)尤建良所創(chuàng)，臨床治療肝癌腹水及肝硬化腹水療效顯著?，F(xiàn)正在對(duì)該藥進(jìn)行進(jìn)一步的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。臨床應(yīng)用該方聯(lián)合順鉑、白介素-2治療肝癌腹水取得良好效果［1］。本研究采用小鼠肝癌腹水模型，旨在評(píng)價(jià)調(diào)氣行水合劑的療效及其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，以探討其治療惡性腫瘤的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純系昆明小鼠72只，雌雄各半，4～6周齡，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（蘇）2007-0003，給予正常飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物及試劑 調(diào)氣行水合劑（方藥組成：柴胡10 g，姜半夏 10 g，黨參 10 g，甘草 6 g，黃芩10 g，炒白術(shù)15 g，桂枝5 g，澤瀉30 g，茯苓30 g，豬苓30 g，莪術(shù)15 g，澤蘭30 g，生姜10 g等。按處方稱取上述藥材，加水浸泡0.5 h，煎煮2次，合并煎液，靜置24 h，濾過，濾液濃縮至 300mL，含生藥量 0.703 g／mL），順鉑針10mg／支（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：3090241DB），白介素-2注射液50萬(wàn)單位／支（北京四環(huán)生物制藥有限公司，批號(hào)：201103006）。0.9%氯化鈉注射液500 mL／袋（江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110308009）。

Caspase-3，bax一抗（scbt公司）；TGF-β1一抗（epitomics公司）；SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；小鼠H22肝癌細(xì)胞株（江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.1.3 儀器設(shè)備 數(shù)顯恒溫水浴箱HH.W21-Cr600（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；電子天平AL104（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TD5A-WS臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心儀器有限公司）；Galanz機(jī)械不銹鋼燒烤微波爐WD7505（珠海飛龍電器有限公司）；容聲電冰箱BCD-201／HC（廣東科龍電器公司）；濕盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；LEICA 2135切片機(jī)（上海萊卡公司）；漂烘片機(jī)YABO 200（常州市雅博電子設(shè)備有限公司）；病理組織包埋冷凍臺(tái)BMJ-Ⅲ型（常州中威電子儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱WMK-02（南京醫(yī)用儀器廠）；Olypums BX51顯微鏡（奧林巴斯中國(guó)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模與分組 復(fù)蘇小鼠H22肝癌細(xì)胞株，從液氮罐快速取出裝有冰存細(xì)胞的冰存小管，將冰存小管快速放于40℃水浴搖床中以60 r／min的速度慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入37℃水浴箱，手工慢搖2min，離心棄上清，用生理鹽水將細(xì)胞密度調(diào)至2×1010／L。小鼠腹部用75%酒精消毒，每只腹腔注射0.2mL（約含瘤細(xì)胞4×106）。共接種72只昆明小鼠。隨機(jī)分成空白對(duì)照組、純中藥組、中西藥小劑量組、中西藥中劑量組、中西藥大劑量組、西藥組（每組12只昆明小鼠，雌雄各半）。第5天形成腹水后造模成功。

1.2.2 動(dòng)物給藥 實(shí)驗(yàn)時(shí)依據(jù)陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》［2］推薦的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量換算方法，即：小白鼠的日服藥量＝人的日服藥量×小白鼠與人的體表比（0.0026），對(duì)實(shí)驗(yàn)中小鼠用藥劑量進(jìn)行推算。調(diào)氣行水合劑配成1.463mg／mL水溶液備用，順鉑配成0.156mg／mL，白介素-2配成2600μg／mL水溶液備用。造模成功后開始治療。空白對(duì)照組每日生理鹽水1mL灌胃，西藥組放空小鼠腹水后腹腔內(nèi)注射順鉑1 mL，白介素-21mL，每周1次。純中藥組調(diào)氣行水合劑灌胃給藥，每天2次，每只每次0.2mL。中西醫(yī)結(jié)合治療組在腹腔注射順鉑、白介素的基礎(chǔ)上同時(shí)調(diào)氣行水合劑灌胃給藥每天2次，共15 d。小劑量組每只每次0.2m L；中劑量組0.5mL，大劑量組1mL。

1.2.3 標(biāo)本采集和處理 末次給藥后第二天，將小白鼠斷頸處死，剝離瘤體。瘤體用多聚甲醛固定，用作石蠟切片及免疫組化。

石蠟切片制作步驟：①取材：組織厚度約2～3 mm，大小1.5 cm×1.5 cm×（0.2～0.3）cm；②固定：組織取下后應(yīng)立即放入10%福爾馬林（相當(dāng)于4%甲醛）固定；③漂洗：流水沖洗2～10 h；④脫水：從低濃度酒精到高濃度酒精，70%（數(shù)分鐘）→80%（60～120min）→90%（60～120min）→95%（60～120min）→95%（60～120min）→100%（60～120 min）→100%（60～120min）；⑤透明：二甲苯浸泡30min；⑥浸蠟：3～4 h；⑦包埋：先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入，包埋面必須平整，包埋后待石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固；⑧切片：修塊→切片→展片→撈片→烤片。

免疫組化操作步驟：①石蠟切片脫蠟；②30%H2O2室溫孵育30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，重復(fù)2次；④5%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清。滴加一抗工作液（稀釋倍數(shù)1∶1 000），4℃過夜；⑤PBS沖洗5min，重復(fù)3次；⑥滴加二抗工作液（稀釋倍數(shù)1∶2000），37℃孵育30min；⑦PBS沖洗5min，重復(fù)3次；⑧滴加SABC試劑，37℃放置30min；PBS（pH7.2～pH7.6）沖洗5min，重復(fù)4次；⑨PBS沖洗5 min分鐘，重復(fù)3次；⑩滴加DAB顯色液，5min，直至顯棕色為止；○11蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.4 鏡檢分析 200倍光鏡下，選取每張切片中caspase-3，TGF-β，Bax著色最明顯的10個(gè)視野，以捷達(dá)801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)采集圖像并半定量檢測(cè)染色陽(yáng)性物質(zhì)的面積和積分光密度，求其每視野的平均值，表示以上2種物質(zhì)的含量。圖像采集分析方法采用數(shù)碼顯微鏡捕捉免疫組化圖片（jpg格式）：?jiǎn)?dòng)捷達(dá)801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化圖片分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組bax蛋白表達(dá)情況 中西醫(yī)結(jié)合大劑量組bax蛋白表達(dá)明顯增加，與空白對(duì)照組比較有極顯著差異。與西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。純中藥組及中西醫(yī)結(jié)合中、小劑量組與對(duì)照組及西藥組無(wú)明顯差異（見表1、圖1）。

表1 各組bax蛋白染色陽(yáng)性物質(zhì)的面積和積分光密度Tab.1 The image area and integral optical density of bax expression protein in every group

圖1 各組bax蛋白染色結(jié)果（×200）Fig.1 Staining results of bax protein（×200）

2.2 Caspase-3蛋白表達(dá) 中西醫(yī)結(jié)合中、大劑量組及西醫(yī)組Caspase-3蛋白染色陽(yáng)性物質(zhì)及積分光密度與對(duì)照組差異極顯著，中西醫(yī)結(jié)合大劑量組與西醫(yī)組比較差異顯著（見表 2、圖2）。

表2 各組Caspase-3蛋白染色結(jié)果Tab.2 the image area and integral optical density of Caspase-3 expression protein in every group

圖2 各組Caspase-3染色結(jié)果（×200）Fig.2 Staining results of Caspase-3 in different groups（×200）

2.3 各組TGF-β1蛋白表達(dá)情況 The expression of TGF-β1

中西醫(yī)結(jié)合中、大劑量組TGF-β1蛋白染色陽(yáng)性物質(zhì)及積分光密度與對(duì)照組差異極顯著，中西醫(yī)結(jié)合大劑量組與西醫(yī)組比較差異極顯著（見表3，圖3）。

表3 各組TGF-β1蛋白染色陽(yáng)性物質(zhì)的面積和積分光密度Tab.3 the image area and integral optical density of TGF-β1 expression protein in every group

圖3 各組TGF-β1染色結(jié)果（×200）Fig.3 Staining results of TGF-β1 in different groups（×200）

3 討論

細(xì)胞的增殖、分化和凋亡相互協(xié)調(diào)，維持正常組織的生長(zhǎng)平衡。如果打破這種平衡，凋亡受抑，增殖增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低，而機(jī)體又不能重新恢復(fù)調(diào)節(jié)，則表現(xiàn)為生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，最終形成腫瘤。有觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可能起源于正常情況下本應(yīng)該走向凋亡而未發(fā)生凋亡的細(xì)胞［3］。而腫瘤細(xì)胞群為了維持整體的高度增殖，會(huì)對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行抗細(xì)胞凋亡的檢驗(yàn)，保留那些能抗拒細(xì)胞凋亡而得以存活的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)為癌細(xì)胞。也就是說，腫瘤細(xì)胞的高增殖能力，一方面來(lái)自于腫瘤細(xì)胞的高增殖能力和低分化程度，另一方面來(lái)自于癌細(xì)胞的凋亡被抑制、生存延長(zhǎng)。這在濾泡型B淋巴瘤中已得到證實(shí)［4］。調(diào)氣行水合劑為經(jīng)方小柴胡湯與五苓散合方加莪術(shù)、澤蘭，臨床應(yīng)用配合順鉑、白介素-2腹腔灌注治療肝癌腹水取得良好療效［1］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：日本的神代正道［5］對(duì)小柴胡湯的幾種水溶性成分柴胡皂苷、人參皂苷、甘草甜素、黃芩皂苷和小柴胡湯的水溶性全部成分，分別處理體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株、膽管癌細(xì)胞株、正常大鼠肝細(xì)胞和正常人外周淋巴細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各藥效成分單獨(dú)使用對(duì)2癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)率很低，而小柴胡湯全成分作用最為明顯。齊元富等［6］運(yùn)用三棱和莪術(shù)來(lái)治療各期腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)其可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善血液循環(huán)，抑制并殺滅癌細(xì)胞，緩解病情等。機(jī)制可能是莪術(shù)提取物欖香烯能阻滯HL260細(xì)胞從S期進(jìn)入G2期及M期，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［7］。莪術(shù)醇對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有較明顯的抗腫瘤作用，其發(fā)揮抗腫瘤作用在于抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。為進(jìn)一步了解該方法的作用機(jī)理，我們采用小鼠H22肝癌細(xì)胞株腹腔內(nèi)注射形成小鼠肝癌腹水模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其療效及其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡基因的影響。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，調(diào)氣行水合劑純中藥組及中西醫(yī)結(jié)合中小劑量組與空白對(duì)照組比較bax蛋白表達(dá)未見增加，中西醫(yī)結(jié)合大劑量組bax蛋白表達(dá)明顯增加，與空白對(duì)照組比較有極顯著差異（P＜0.01）。與西藥組比較差異顯著。當(dāng)細(xì)胞受到藥物作用發(fā)生DNA損傷時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)下游蛋白Bax等的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡過程，引起細(xì)胞凋亡［9］。故bax蛋白表達(dá)的增加明確提示了細(xì)胞凋亡的增加。

Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”。正常情況下。胞質(zhì)中的Caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在，細(xì)胞凋亡信號(hào)的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3在多種蛋白水解酶的作用下發(fā)生裂解而活化，從而引發(fā)凋亡［10］。本研究顯示中西醫(yī)結(jié)合中大劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，與空白對(duì)照組比較有極顯著意義（P＜0.01）。與西藥組比較差異極顯著（P＜0.01）。中西醫(yī)結(jié)合中大劑量組均促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可明顯誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡［11］。TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要依賴Caspase-3和Caspase-8。TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞的凋亡。TGF-β1通過激活caspase-9途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞凋亡［12］。本研究顯示中西醫(yī)結(jié)合中大劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加，與空白對(duì)照組比較有極顯著意義。中西醫(yī)結(jié)合中大劑量組均增加Caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果顯示大劑量組調(diào)氣行水合劑聯(lián)合順鉑、白介素-2腹腔注可明顯增加細(xì)胞凋亡基因 Bax、caspase-3、TGF-β1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組及西藥組比較差異均有極顯著意義及顯著意義。中劑量組調(diào)氣行水合劑聯(lián)合順鉑、白介素-2腹腔注亦可明顯增加細(xì)胞凋亡基因caspase-3、TGF-β1的表達(dá)。純中藥組及中西醫(yī)結(jié)合小劑量組均未見細(xì)胞凋亡基因表達(dá)增加?？梢娬T導(dǎo)細(xì)胞凋亡是中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌腹水的機(jī)理之一，并具有對(duì)中藥的劑量依賴型。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：吳荻等［13］消水湯治療肝癌腹水的臨床及實(shí)驗(yàn)研究有中藥復(fù)方對(duì)肝癌腹水的臨床觀察。提示中藥復(fù)方對(duì)肝癌腹水治療有效，但實(shí)驗(yàn)研究?jī)H對(duì)療效進(jìn)一步評(píng)價(jià)無(wú)作用機(jī)制研究。熊忠太等［14］調(diào)營(yíng)飲對(duì)小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔直徑、面積、周長(zhǎng)及密度的影響研究了復(fù)方中藥對(duì)肝癌腹水模型腹膜淋巴管的影響。齊元富等［15］六神丸對(duì)H22肝癌腹水移植瘤PDGF與VEGF表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制探討。提示六神丸抗腫瘤血管生成的機(jī)理與其抑制PDGF與VEGF表達(dá)密切相關(guān)。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，起效常有多方面作用機(jī)制?？蓪?duì)調(diào)氣行水合劑的作用機(jī)制對(duì)抗腫瘤血管生成方面作用，做進(jìn)一步的研究。

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（編校：吳茜）

Effect of the Tiao qi xing shui Decoxction on Bax，Caspase-3，
TGF-β1 Gene expression in mouse w ith ascetes hepatoma

YANG Zhi-xin，YOU Jian-liangΔ，PU Qiong-hua

（Department of Oncology，TCM Hosipital ofWuxi City，Wuxi214001，China）

ObjectiveTo investgate the effectof Tiao qi xing shui decoction combined with peritoneal injection DDP and IL-2 on Bax，Caspase-3，TGF-β1 gene expression in mouse with ascetes hepatoma，and explore itsmechanism from molecular biology.Methods72 pure lines of Kunmingmice were random ly divided into control group，Chinesemedicine group，combination of traditional Chinese and Westernmedicine，in high，middle，low dose group and Westernmedicine group，each had 12.Allmiceswere killed after treatment，and the expression of Bax，Caspase-3，GF-β1 protein inmouse liver tumor tissues were detected by Immunohistochemical.ResultsImmunohistochemical results showed that，the positive expression of apoptosis gene Bax protein in high dose group of TCM and Western Medicine was higher than that of control group（P＜0.01），and the positive expression of apoptosis gene Caspase-3，TGF-β1 protein in high and middle dose group of TCM and Western Medicine were higher than that of control group（P＜0.01）.ConclusionThe high dose group of TCM and Western Medicine can significantly increase the expression of Bax protein，the high and middle dose guoup of TCM and Western Mdicine can significantly increase the expression of Caspase-3，TGF-β1 protein，induction apoptosis.

hepatoma ascites；Tiao qi xing shui decoction；Bax；Caspase-3；TGF-β1；program cell death

R273

A

1005－1678（2014）03－0064－04

醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金無(wú)錫市醫(yī)管中心科研項(xiàng)目（YGZ1010）

楊志新，男，研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤臨床研究，E-mail：zhixin_yang＠sina.com；尤建良，通信作者，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤臨床研究，E-mail：yjl1104＠21cn.com。