五種芽孢桿菌對小菜蛾的拒食作用及對Bt殺蟲增效作用的研究

張貴森,劉慧芹,2，張寶俊， 韓巨才，劉慧平

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院, 山西 太谷 030801; 2.天津農(nóng)學院 園藝系, 天津 300384)

五種芽孢桿菌對小菜蛾的拒食作用及對Bt殺蟲增效作用的研究

張貴森1,劉慧芹1,2，張寶俊1， 韓巨才1，劉慧平1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院, 山西 太谷 030801; 2.天津農(nóng)學院 園藝系, 天津 300384)

采用浸葉法測定了芽孢桿菌LP-5、LB-2、YC-8、F-3、LP-1對小菜蛾的拒食作用，比較了5種菌株對小菜蛾的非選擇性和選擇性拒食作用。結果表明LP-5在處理48 h后的非選擇性拒食率和選擇性拒食率分別高達91.30%和90.76%，具有較明顯的拒食作用。同時，不同濃度的LP-5發(fā)酵液對蘇云金芽孢桿菌(Bt)制劑的殺蟲活性有不同程度的影響，均對Bt具有增效作用，其中原液與Bt制劑的混合液的增效達44.78%。

小菜蛾；芽孢桿菌；拒食作用；Bt；增效作用

近年來，國內(nèi)外廣泛利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制病蟲害的生存和活動，使這一防治策略發(fā)展迅速，其中拮抗細菌在植物病蟲害防治中起到非常重要的作用，無論是自然發(fā)生的生物防治現(xiàn)象還是人們用于生物防治的生物類型中，細菌的作用是非常明顯的[1]。利用細菌殺蟲已經(jīng)有100多年的歷史，目前篩選的殺蟲細菌有100多種。其中開發(fā)成產(chǎn)品的主要有4種：蘇云金芽孢桿菌(Bt)、球形芽孢桿菌(Bs)、日本金龜子芽孢桿菌和緩死芽孢桿菌。在這4種細菌中又以前兩種細菌為主[2]。芽孢桿菌是一群好氧或兼性厭氧、產(chǎn)芽孢的G+桿菌的總稱，其生理特征豐富多樣，分布極其廣泛，極易分離培養(yǎng)，是土壤和植物體表、根際的重要微生物種群[3]。它還能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，這有利于商品化生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，種類繁多是一種較理想的生防微生物[4]。小菜蛾(PlutellaxylostellaL.) 屬鱗翅目，菜蛾科。全國各地均有發(fā)生，危害甘藍、花椰菜、白菜、油菜、蘿卜等十字花科蔬菜[5,6], 但以南方各省廣大蔬菜產(chǎn)區(qū)和西部油菜產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為嚴重[7]。但是近年來，隨著蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)的大量使用，小菜蛾對其產(chǎn)生抗藥性。馮夏[8]報道廣東深圳、東莞地區(qū)等供港菜區(qū)小菜蛾對Bt的抗性為17.97～30.65倍。李建洪等[5]對深圳、東莞和廣州菜區(qū)的田間小菜蛾種群檢測結果表明，對上海、深圳、東莞的田間小菜蛾種群監(jiān)測結果表明, 抗性分別達611倍、819倍和615倍。為了提高Bt對小菜蛾的毒殺作用，國內(nèi)外許多學者一直在研究提高Bt殺蟲效果的方法[9]。本實驗對拮抗芽孢桿菌的抗蟲作用進行了研究，測定了5種內(nèi)生細菌對小菜蛾的拒食作用，選出拒食率相對較高的菌株。同時，將其與Bt混用來初步研究它們對Bt的增效活性。由于植物內(nèi)生細菌能夠顯著影響B(tài)t的殺蟲活性，這對減少環(huán)境污染、降低小菜蛾的抗藥性具有指導意義，以期能對防治小菜蛾為害提供理論依據(jù)和有效方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物內(nèi)生細菌LP-5、LB-2、YC-8、F-3、LP-1由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥實驗室分離純化保存。

1.1.2 試驗對象

小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)，在溫室25℃±1℃，相對濕度70%±10%，L/D=14/10條件下人工飼養(yǎng)。幼蟲飼喂甘藍，成蟲飼喂5%蜂蜜水，取2～3齡的幼蟲測試。

1.2 研究方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

將5個菌株分別接種于BPY培養(yǎng)液中(蛋白胨 1%、牛肉浸膏 0.5%、酵母粉 0.5%、葡萄糖 0.5%、NaCl 0.5%，pH為7.0)，28℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h后，10 000 r·min-1離心20 min去除菌體獲得發(fā)酵液。

1.2.2 非選擇性拒食作用測定

以浸漬葉碟飼喂法[10]測定。用清水將新鮮的甘藍葉片洗凈晾干，用圓形打孔器(直徑=1.5 cm)打成葉碟，分別放入到5個菌株的發(fā)酵液處理30 s，以清水為對照，取出晾干后轉(zhuǎn)入墊有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中放4枚處理葉蝶，接入1頭已饑餓6 h的小菜蛾3齡幼蟲。于24 h后用坐標紙測定取食葉面積，更換新鮮處理葉蝶，48 h后再次調(diào)查取食葉面積。試驗重復3次，并按如下公式計算拒食率，用Duncan氏方法比較各處理間的差異。

非選擇性拒食率/%= (對照取食葉面積-處理取食葉面積)/對照取食面積×100

1.2.3 選擇性拒食作用測定

在培養(yǎng)皿中放入對照和處理葉蝶各2枚，然后接入饑餓6 h的小菜蛾3齡幼蟲1頭，其余同非選擇性拒食作用測定。試驗重復3次，并按公式計算拒食率，用Duncan氏方法比較各處理間的差異。

選擇性拒食率/%= (對照取食葉面積-處理取食葉面積)/(對照取食葉面積+處理取食葉面)×100

1.2.4 增效作用測定

稱取0.1 g Bt粉劑，分別稀釋成250，500，1000倍液，將甘藍葉片洗凈晾干，浸漬在上述3種稀釋液30 s，取出晾干，轉(zhuǎn)入墊有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中接入10頭小菜蛾3齡幼蟲。于24 h后檢查結果，調(diào)查死亡的幼蟲個數(shù)。以清水為對照。3次重復。選擇最適合Bt的濃度，進行增效試驗測定。

選用拒食率高的菌株發(fā)酵液用無菌水分別稀釋5、10、20倍，加入1000 mg·L-1的Bt制劑。測定不同濃度混合液對小菜蛾的毒殺作用。方法如上。并按公式計算校正死亡率：

校正死亡率/%=(對照組生存率-處理組生存率)/對照組生存率×100

試驗和飼養(yǎng)蟲的溫度均為25℃, 試驗數(shù)據(jù)Microsoft Excel 2003和SASV8.01軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 非選擇性拒食作用測定

測定結果見表1，不同的植物內(nèi)生細菌對小菜蛾都有不同程度的拒食作用。非選擇性拒食作用隨著時間的增加而降低。在非選擇性拒食中，LP-5 、F-3、YC-8、LP-1的作用較明顯，其中以LP-5的作用最強，處理24 h后的拒食率高達97.01%，與F-3、LB-2差異不顯著，與其它兩種菌株差異顯著。而LP-5處理48 h后的拒食率仍高達91.30%，與其它四種菌株差異顯著，由此可見LP-5的非選擇性拒食作用效果最好。

2.2 選擇性拒食作用測定

測定結果見表1，選擇性拒食中也是LP-5的拒食率最高，處理48 h后的拒食率高達90.76%。而其他的選擇性拒食作用不明顯。由此可以看出，LP-5對小菜蛾有強烈的拒食作用。綜合考慮菌株的毒性及對小菜蛾的生物活性，認為LP-5可以用于增效試驗的測定。

表1 不同菌株對小菜蛾的拒食作用

注：表中的小寫字母和大寫字母分別表示新復極差檢驗中0.05和0.01的差異顯著性。

Note： The data in the same columns following by the same letters are significantly different by Duncan's test (P=0.05) or (P=0.01)

2.3 增效作用測定

2.3.1 不同稀釋液的Bt對小菜蛾的毒殺作用

測定結果見表2，生物殺蟲劑Bt的不同稀釋液對小菜蛾都有不同程度的毒殺作用，由于Bt的250、500倍稀釋液在48 h內(nèi)的校正死亡率分別為87.5%和75.0%，毒殺作用較明顯，而在1000倍的稀釋液中，48 h內(nèi)的校正死亡率為25.0%，毒殺作用不明顯。對1000倍的Bt稀釋液作增效試驗。

表2 不同濃度的Bt對小菜蛾的毒殺作用

2.3.2 LP-5不同稀釋液對Bt殺蟲效果的影響

測定結果見表3，LP-5不同稀釋液與1000倍的Bt稀釋液混合，其對小菜蛾的毒殺作用有不同程度的增加。毒殺作用隨著LP-5稀釋倍數(shù)的升高而有所減小，其中原液與Bt的混合液比Bt單劑增效了44.78%，增效程度較明顯；20倍的LP-5稀釋液的增效程度僅為3.41%，由此可見，植物內(nèi)生細菌LP-5對1000倍的Bt稀釋液具有增效作用。

表3 LP-5不同濃度的LP-5發(fā)酵液對Bt殺蟲效果的影響

3 討論與結論

Bt克服了傳統(tǒng)化學農(nóng)藥污染環(huán)境、對人畜不安全等缺點，具有對昆蟲天敵、人畜安全，不污染環(huán)境，昆蟲不容易產(chǎn)生抗性等特點，因此被廣泛應用于農(nóng)、林、醫(yī)、倉儲等領域的害蟲生物防治，是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的90%～95%[11]。但是Bt還具有菌種容易退化、基因產(chǎn)物表達水平受細菌自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)及毒素基因拷貝數(shù)的限制、殺蟲范圍窄、有效成分易分解等缺點。然而迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多昆蟲能夠?qū)t產(chǎn)生抗性[5,8,12]。

細菌源農(nóng)藥本身對害蟲具有一定的毒殺作用，對環(huán)境無污染，在自然條件下易降解，對人畜無毒，使用安全，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求[13]。為了驗證植物內(nèi)生菌LP-5具有細菌源農(nóng)藥的特征，本實驗發(fā)現(xiàn)LP-5對小菜蛾具有拒食作用，同時對Bt防治小菜蛾具有一定的增效作用，尤其是原液的增效程度達44.78%。因此LP-5正是具有這種特性的潛在生防菌，特別是與其它農(nóng)藥混用，可提高農(nóng)藥的防治效果，增加農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟收益，這在生產(chǎn)上具有較好的應用前景。

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TheAntifeedingEffectsofFiveStrainsofBacillusonPlutellaxylostellaandSynergisticEffectsonBt

Zhang Guisen1,Liu Huiqin1,2, Zhang Baojun1, Han Jucai1, Liu Huiping1

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2.DepartmentofHorticulture,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

The antifeeding effects ofBacillusLP-5, LB-2, YC-8, F-3, LP-1 onPlutellaxylostellawere tested with leaf dipping method. Non-selective and selective effects of five strains ofBacillusonPlutellaxylostellawere compared. The results showed that non-selective and selective antifeeding rates by LP-5 reached 91.30% and 90.76%, respectively, showing significant effects. Meanwhile, fermentation broth of LP-5 with different concentrations had different effects on the activity ofBacillusthuringiensis(Bt), though all showed synergistic effect. Moreover, synergistic effect of the crude fermentation broth with Bt reached 44.78%.

Plutellaxylostella;Bacillus; Antifeeding; Bt; Synergy

2014-04-29

2014-05-27

張貴森(1985-)，男(漢)，山西朔州人，助教，研究方向：農(nóng)藥制劑加工應用。

韓巨才，教授，博士生導師，Tel：0354-6288679；E-mail: sxndhjc@163.com

山西省科技基礎條件平臺建設項目(2014091003-0102)；山西省科技攻關項目( 20110311013-1)；山西省財政支持農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金(SCZZNCGZH201304)

S476

A

1671-8151(2014)05-0407-04

(編輯：武英耀)