水淹脅迫下三峽庫區(qū)野生狗牙根根系酶活性變化

李彥杰，劉仁華，楊俊年，周大祥，秦洪文

（1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000；2.三峽庫區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心，重慶404000）

三峽水庫完成175 m蓄水后，自宜昌三峽大壩到其上游的重慶江津形成長(zhǎng)度超過660 k m，最寬2 k m，面積約1萬k m2的峽谷型人工水庫［1］。在三峽水庫的反季節(jié)周期性蓄水過程中，可在水庫沿岸形成最高水位達(dá)175 m，最低水位為145 m，落差達(dá)30 m的消落帶，使得庫區(qū)沿岸生態(tài)結(jié)構(gòu)由陸生生態(tài)系統(tǒng)演變?yōu)橹芷谛缘亩年懴鋷竦叵到y(tǒng)［2］。消落帶環(huán)境的劇烈改變，打破了原有生態(tài)平衡，使得大部分植物因不適應(yīng)而死亡。消落帶植被消亡加劇引發(fā)了眾多環(huán)境問題，如污染、水土流失等［3］。消落帶治理目前一致的看法是恢復(fù)或者重建消落帶的植被，其中篩選消落帶適生植物是一個(gè)重要的方向。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者在三峽庫區(qū)消落帶的適生植物篩選方面做了大量研究，如利用模擬水淹和實(shí)際水淹篩選到了數(shù)種適生植物［4－6］，其中劉云峰等［7］通過在三峽庫區(qū)萬州段的自然消落帶通過實(shí)際水淹實(shí)驗(yàn)，提出了消落帶鄉(xiāng)土植物狗牙根可作為三峽庫區(qū)消落帶治理適生植物。后續(xù)的研究表明［8］，在長(zhǎng)時(shí)間（大于180 d）不同深度水淹生境下，狗牙根具有接近100%的高存活率，故被認(rèn)為是三峽庫區(qū)消落帶治理的適生植物之一。

水淹脅迫生境下，因光和氧的強(qiáng)度下降會(huì)影響植物的物質(zhì)代謝及誘發(fā)缺氧脅迫等。狗牙根作為耐水淹植物之一，有較強(qiáng)的水淹抗性和水淹結(jié)束后能適應(yīng)復(fù)氧脅迫并盡快的恢復(fù)至未脅迫狀態(tài)。到目前為止，適生狗牙根的長(zhǎng)期深度水淹脅迫的生理機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以三峽庫區(qū)自然消落帶狗牙根（XC）和非消落帶狗牙根（FC）為研究材料，通過實(shí)際水淹，對(duì)XC組狗牙根在不同水淹深度下的抗氧化酶活性和碳水化合物含量等變化趨勢(shì)與FC組作對(duì)比，以期從生理角度為狗牙根作為三峽庫區(qū)消落帶治理的適生植物作一解釋。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

狗牙根（Cynodon dactylon L.Pers）屬禾本科多年生草本植物，根系發(fā)達(dá)，具根狀莖及匍匐枝，可做牧草、園藝植物及水土保持植物等；主要分布于黃河流域以南地區(qū)和新疆等地，其中在長(zhǎng)江流域廣泛存在。

實(shí)驗(yàn)用野生狗牙根分為非消落帶野生狗牙根（FC）和自然消落帶野生狗牙根（XC），非消落帶野生狗牙根（FC）選自實(shí)驗(yàn)基地附近非消落帶野生狗牙根，并集中栽培；自然消落帶野生狗牙根（XC）由重慶三峽學(xué)院三峽庫區(qū)消落帶適生植物篩選示范基地提供，該基地位于重慶市萬州區(qū)新田鎮(zhèn)譚紹村，屬于蓄水水位在145～175 m間的三峽庫區(qū)自然消落帶區(qū)域。

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于重慶市萬州區(qū)新田鎮(zhèn)譚紹村的三峽庫區(qū)自然消落帶（107°87′E，30°35′N），屬亞熱帶暖濕東南季風(fēng)氣候，冬暖夏熱，雨量充足、日照時(shí)間長(zhǎng)、四季分明；多年年平均氣溫17.7℃、降雨量1 293 mm、日照1 205 h、無霜期302 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2011年9月16—18日，選取生長(zhǎng)一致的三峽庫區(qū)自然消落帶野生狗牙根（XC）（重慶三峽學(xué)院三峽庫區(qū)消落帶適生植物篩選示范基地）和非消落帶野生狗牙根（FC）（175 m以上的實(shí)驗(yàn)基地）當(dāng)年生分蘗苗分別移入塑料桶中；桶內(nèi)徑42 c m、高18 c m，桶底打孔，并墊上窗紗后填譚紹村自然消落帶濕潤(rùn)沙土，桶內(nèi)土層厚度為14 c m。

2011年10月30日三峽水庫完成蓄水，于次日開始水淹實(shí)驗(yàn)；具體為：XC組隨機(jī)分為0，4，8，12，16，20 m水淹組，每組含6個(gè)平行樣做不同水淹下沉處理；FC組在175 m之上做對(duì)照。取樣時(shí)間為2012年4月28日，水淹時(shí)間181 d。

1.3 取樣及指標(biāo)測(cè)定

2012年4月28日開始取樣。取樣時(shí)，小心掰開桶中的土，取出完整的植株，沖洗干凈根部泥土，剪下根系，用蒸餾水沖洗三遍后用吸水紙吸干，稱取約1.0 g放入冰盒立即帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后放入－70℃?zhèn)溆?；取洗凈后剩余的根系帶回?shí)驗(yàn)室烘至恒重。

丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法［9］，含量單位為 mg／（g·min）F W；乙醇脫氫酶（ADH）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，酶活性單位為U／g F W；過氧化物酶（POD）酶活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［9］，酶活性單位為 ΔOD470／（g F W·min）；谷光甘肽還原酶（GR）酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，含量單位為單位為n mol／g F W。超氧化物歧化酶（SOD）酶活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑比色法［9］，酶活性單位為 U／g F W；游離的脯氨酸測(cè)定采用茚三酮法［9］，含量單位為 μg／g FW；可溶性糖和淀粉參照張志良［9］等測(cè)定方法并略作修改，含量單位為mg／g。

1.4 分析方法及作圖

SPSS 19.0（IBM，USA）作不同對(duì)照組t檢驗(yàn)；Origin 8.5（Origin Lab，USA）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水淹深度對(duì)MDA含量的影響

不同水淹深度對(duì)MDA含量影響（圖1）結(jié)果顯示：隨著水淹深度的增加，XC組狗牙根根系的MDA含量呈遞增趨勢(shì)；從水淹4 m處起XC組根系MDA含量顯著高于未淹沒的FC組（P＜0.05）；未淹沒FC組狗牙根根系MDA含量基本處于同一水平。

圖1 水淹深度對(duì)MDA含量的影響

2.2 不同水淹深度對(duì)ADH酶與抗氧化酶酶活性及游離脯氨酸含量的影響

不同水淹深度對(duì)酶活性的影響（圖2）結(jié)果顯示：隨著水淹深度的增加，XC組狗牙根根系A(chǔ)DH、GR、POD、SOD酶活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；在不同水淹深度生境下，XC組狗牙根根系A(chǔ)DH、POD、SOD酶活性均高于未淹沒FC對(duì)照組水平，而GR酶活性在水淹深度為20 m時(shí)降至FC對(duì)照組水平。

在水淹深度為8 m時(shí)，XC組狗牙根根系A(chǔ)DH、POD和SOD酶活性出現(xiàn)最高值且顯著高于FC組對(duì)照水平（P＜0.01），此時(shí)分別約為FC對(duì)照組水平的2.1，2.4，5.2倍；而 GR酶活性的最高值出現(xiàn)在水淹深度為4 m時(shí)且顯著高于FC對(duì)照組水平，約為FC對(duì)照組水平的3.6倍。此外，在整個(gè)水淹期間，XC組狗牙根根系POD和SOD酶活性均顯著高于FC對(duì)照組水平（P＜0.05）。

圖2 水淹深度對(duì)酶活性影響

隨著水淹深度的增加，XC組狗牙根根系游離脯氨酸的含量呈遞增趨勢(shì)（圖3），且從4 m水淹深度起，均顯著高于FC對(duì)照組水平（P＜0.01）。

圖3 水淹深度對(duì)游離脯氨酸含量的影響

2.3 不同水淹深度對(duì)碳水化合物含量的影響

不同水淹深度下，XC組狗牙根根系可溶性糖含量呈先遞減后上升的趨勢(shì)，其中在水淹深度為8 m時(shí)，可溶性糖含量降至最低，約為FC對(duì)照組水平的40%（圖4）；在整個(gè)水淹期間，XC組狗牙根根系可溶性糖含量均顯著低于FC對(duì)照組水平（P＜0.01）。XC組狗牙根根系淀粉含量在水淹深度為4 m時(shí)出現(xiàn)最低值，且約為FC對(duì)照組水平的60%（圖4）；在8 m深度處恢復(fù)至對(duì)照水平，且此后基本和FC對(duì)照組處于同一水平。

3 結(jié)論與討論

水淹脅迫對(duì)植物細(xì)胞生理的影響主要表現(xiàn)為缺氧和光合作用下降。尤其在長(zhǎng)期水淹生境下，長(zhǎng)期性的缺氧使得植物細(xì)胞呼吸鏈的電子不能傳遞給其受體氧（O2），這會(huì)使得三磷腺苷（ATP）的合成受阻；此外，植物根系組織在水淹生境下，也會(huì)誘發(fā)膜脂發(fā)生過氧化作用，生成氧化應(yīng)激的標(biāo)志物MDA，MDA含量高低反映了植物細(xì)胞膜過氧化作用的強(qiáng)弱與質(zhì)膜的破壞程度，且其可影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性［10］；作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)，游離脯氨酸隨水淹脅迫增加而呈增加趨勢(shì)，且其含量與植物耐澇性之間存在相關(guān)性［11］。本實(shí)驗(yàn)中，隨著水淹深度的增加，XC組狗牙根根系MDA的含量呈遞增趨勢(shì)，反映了脅迫程度的加重，與文獻(xiàn)［12］報(bào)道一致；XC組狗牙根根系游離脯氨酸隨著水淹深度增加也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，這與已有的相關(guān)報(bào)道［11］一致。

圖4 水淹深度對(duì)碳水化合物含量的影響

長(zhǎng)期水淹生境下，因?yàn)槿毖跏沟霉费栏w內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡受到破壞，導(dǎo)致根系內(nèi)活性氧自由基大量累積，進(jìn)而對(duì)根系細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，如酶類抗氧化劑（POD、SOD、GR等）和非酶抗氧化劑（抗壞血酸、還原型谷胱甘肽、維生素E、還原性酚類和酮類等）等，通過還原累積的氧自由基從而有效降低水淹脅迫對(duì)植物的傷害。GR可維持植物體內(nèi)的還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比例處于較高水平，這不僅與直接抗氧化有關(guān)（清除H2O2等），而且能促進(jìn)抗壞血酸的再生；POD是以過氧化氫為電子受體，催化過氧化氫氧化某些酚類和胺類化合物。SOD可將植物體內(nèi)的超氧陰離子自由基（O－.2）轉(zhuǎn)化成H2O2和O2，H2O2可進(jìn)一步被過氧化氫酶（CAT）催化產(chǎn)生水及分子氧。研究發(fā)現(xiàn)，大麥［13］、小麥［14］、玉米［15］等植物體內(nèi) GR、POD和SOD酶活性會(huì)在水淹脅迫下增高，以移除或降低水淹脅迫的傷害，從而保護(hù)植物能在水淹下存活。本實(shí)驗(yàn)中XC組狗牙根根系GR、POD和SOD酶活性在水淹條件下均高于FC對(duì)照組（除GR在20 m水淹處），顯示GR、POD和SOD酶活性與抗水淹脅迫有關(guān)；隨著水淹深度增加，植物缺氧和光合作用下降加劇，植物的代謝水平降低以利于存活，表現(xiàn)為合成和代謝均處于較低水平，故GR、POD和SOD酶活性出現(xiàn)下降，其中GR酶活性在20 m水淹深處降至FC對(duì)照組水平；不同抗氧化酶對(duì)不同水淹深度的響應(yīng)基本相同，但XC組狗牙根根系POD和SOD酶活性在水淹深度為8 m時(shí)處于最高水平，而GR酶活性的最高水平出現(xiàn)在水淹深度為4 m時(shí)。

長(zhǎng)期水淹生境下，因供氧不足或缺氧也會(huì)誘發(fā)植株體內(nèi)酒精發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，過量乙醇的累積會(huì)對(duì)植物細(xì)胞和組織產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而引發(fā)酸毒癥［16］。ADH是無氧呼吸的關(guān)鍵酶，它能有效地降低植物體乙醇的大量累積從而降低對(duì)植物細(xì)胞的傷害［17－18］。本實(shí)驗(yàn)中，XC組狗牙根根系A(chǔ)DH酶活性均高于FC對(duì)照組水平，并隨著水淹深度的增加而升高，與大豆根系［17］和春油菜［19］等在水淹條件下 ADH 酶活性升高一致。ADH酶活性最高水平出現(xiàn)在水淹8 m處，此后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能與水淹深度增加脅迫進(jìn)一步加大，而此時(shí)細(xì)胞合成代謝又處于較低水平有關(guān)。

植物碳水化合物包括可溶性糖和淀粉，其中可溶性糖通常是植物體內(nèi)碳水化合物運(yùn)輸和利用的主要形式，淀粉是植物的主要儲(chǔ)存物質(zhì)。有文獻(xiàn)［20］顯示植物碳水化合物含量與植物的水淹抗性呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，XC組狗牙根根系可溶性糖含量隨著水淹深度的增加而降低，其含量較低可能與狗牙根代謝處于較低水平以對(duì)抗逆境有關(guān)；淀粉含量在4 m水淹深度出現(xiàn)最低值而此后與對(duì)照同水平，可能與加大儲(chǔ)能有關(guān)；可溶性糖含量和淀粉含量的變化趨勢(shì)顯示狗牙根能在長(zhǎng)期深度水淹生境下，在減低代謝水平的同時(shí)能增加儲(chǔ)能，說明狗牙根具有較強(qiáng)的耐淹能力。

水淹協(xié)迫下，植物的生理生化代謝會(huì)發(fā)生改變，一方面是適應(yīng)所處的生境，另一方面是降低因?yàn)樯掣淖兛赡軐?duì)植物造成的傷害。通過分析在不同水淹深度下狗牙根根系的酶活力變化和碳水化合物含量等變化，從生理角度解釋了狗牙根在長(zhǎng)期水淹生境下的存活機(jī)制。有關(guān)狗牙根在不同水淹深度下的酶活力動(dòng)態(tài)響應(yīng)信號(hào)途徑，仍有待進(jìn)一步研究。

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