甲殼低聚糖對鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠血糖與腸道菌群的影響

汪茂榮，姚平Δ，張波

（1.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院內分泌科，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系，江蘇南京210029）

甲殼低聚糖對鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠血糖與腸道菌群的影響

汪茂榮1，姚平1Δ，張波2

（1.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院內分泌科，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系，江蘇南京210029）

目的研究甲殼低聚糖對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病小鼠血糖和腸道菌群的影響。方法選取昆明種雄性小鼠45只，隨機分為2組，其中正常對照組為14只，糖尿病模型組為31只，模型組小鼠用STZ誘導使其成為糖尿病，將造模成功的小鼠按照血糖相近的2只分別分在觀察組與模型對照組中。觀察組小鼠用600mg／（kg·d）的甲殼低聚糖灌胃，模型對照組小鼠用等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃21 d后分別檢測2組糖尿病小鼠的血糖以及腸道菌群的差別。結果觀察組糖尿病小鼠的血糖與模型對照組相比顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.001）。觀察組糖尿病小鼠的腸道菌群與模型對照組相比雙歧桿菌的數量顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論甲殼低聚糖可以有效降低鏈脲佐菌素（STZ）糖尿病小鼠的血糖以及改變小鼠腸道菌群的數量。

甲殼低聚糖；鏈脲佐菌素；糖尿病小鼠

殼聚糖（chitosan）產生的降解物是甲殼低聚糖（chitooligosaccharides），殼聚糖屬于高分子生物類的多糖，被廣泛地應用于醫(yī)學方面，具有多種功能，其中包括：免疫調節(jié)、降血脂、抗癌抑癌等［1］。但是殼聚糖的相對分子量很大且不能夠直接溶于水，所以其應用受到一定程度的限制。采用適當的方法由殼聚糖分子得到其降解產物（甲殼低聚糖），能夠充分溶于水、其性能優(yōu)于殼聚糖［2］。本實驗研究了甲殼低聚糖對鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和腸道菌群的影響，旨在探討甲殼低聚糖作用于糖尿病小鼠的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：2～3周昆明種雄性小鼠（合格證號：醫(yī)動字第01-3023號），體質量30～40 g，購自清華大學醫(yī)學部。本研究遵循《實施動物保護條例》。

1.1.2 試劑：甲殼低聚糖在南京醫(yī)科大學生物化學的教研室中利用殼聚糖通過雙氧水在常溫下降解制備得到，其降解產物中含有50%聚合度為3～7的寡糖，與45%聚合度為2～20的殼低聚糖；STZ為Sigma-Aldrich公司產品；血糖測定的試劑盒為上海醫(yī)藥（集團）有限公司產品；枸櫞酸-枸櫞酸鈉購自海南國棟有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的構建及分組：小鼠共45只，隨機分為2組，其中正常對照組為14只，糖尿病模型組為31只。糖尿病模型組通過正常小鼠來制備，先用pH4.5，濃度0.1 mol／L的枸櫞酸鈉緩沖液來對STZ進行稀釋，然后對小鼠進行腹腔注射其注射量為200mg／kg［3］，正常對照組的小鼠進行腹腔注射等體積的緩沖液。3 d后對小鼠進行尾靜脈采血，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖，把血糖超過11.1mmol／L的小鼠定為糖尿病模型小鼠，血糖低于11.1mmol／L的小鼠剔除；同時提取小鼠無菌糞便進行細菌培養(yǎng)。模型組的小鼠共30只按照血糖相近的2只分別分在糖尿病觀察組與糖尿病對照組中。

1.2.2 治療方法：糖尿病觀察組的小鼠以3%的甲殼低聚糖溶液灌服，其灌服的劑量按照600 mg／kg［3］，糖尿病對照組的小鼠用等體積蒸餾水進行灌服，連續(xù)灌服21 d后檢測2組糖尿病小鼠的空腹血糖，同時提取小鼠無菌糞便進行細菌培養(yǎng)。在實驗期間糖尿病對照組的小鼠死亡1只，把對應的糖尿病觀察組的小鼠剔除，在實驗結束后，2組各剩14只小鼠。

1.2.3 樣本采集及處理方法：提取0.1～0.2 g小鼠無菌糞便置于無菌瓶中，按照1∶10用枸櫞酸-枸櫞酸鈉稀釋液進行稀釋，然后用振蕩器振蕩15min使溶液充分稀釋，再逐次對溶液進行10倍系列的稀釋直至10－7。根據選擇的培養(yǎng)基取用適宜稀釋度的溶液進行滴種，然后根據細菌的需氧、厭氧進行培養(yǎng)，并記錄各個細菌的菌落數。菌落形成單位（colony-forming units，CFU）／g＝菌落數×10n×40，其中：10n為對應于菌落數的稀釋度，40是換算常數，結果用每克糞便中的細菌菌落對數值來表示。

1.3 統計學分析 所有實驗檢測重復3次，用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，正態(tài)計量數據用“±s”表示，計量資料的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 STZ糖尿病小鼠造模結果 模型組30只小鼠的血糖值均高于11.1mmol／L。

2.2 甲殼低聚糖對STZ糖尿病小鼠的血糖影響 模型對照組血糖水平顯著高于正常對照組，差異具有統計學意義（P＜0.001）；觀察組小鼠在甲殼低聚糖治療后的血糖與模型對照組相比顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.001，見表1）。

表1 甲殼低聚糖對STZ糖尿病小鼠的血糖影響（mmol／L）Tab.1 Effect of chitooligosaccharides on blood sugar in STZ induced diabetic mice（mmol／L）

2.3 小鼠的腸道菌群的比較 對小鼠注射鏈脲佐菌素72 h后，模型對照組的乳桿菌和雙歧桿菌的數量明顯的下降，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.001，見表2）；觀察組灌服甲殼低聚糖后雙歧桿菌數量有明顯恢復，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01，見表2）。

表2 甲殼低聚糖對STZ糖尿病小鼠的腸道菌群影響（每g糞便）Tab.2 Effect of the chitooligosaccharidesin on intestinal flora in STZ induced diabeticmice（per gram of feces）

3 討論

甲殼低聚糖的應用前景十分廣闊［4-5］，在醫(yī)藥、化妝品和保健食品方面具備獨特功能。有相關研究表明［6-7］：低聚糖能使巨噬細胞的功能得到提高，促進脾臟的抗體產生以及能夠抑制腫瘤的生長；還能夠降低血清和肝臟中的血脂及膽固醇的含量；增強機體的免疫力而有效地抵抗疾??；防止胃潰瘍和痛風等。近年來用甲殼低聚糖為材料制成的化妝品效果很好。能夠保濕、抑菌和促進毛發(fā)生長。此外甲殼低聚糖的抗菌作用強可以抑制食品中的霉菌、酵母菌等真菌和細菌等，被應用于食品的保存與防腐［8-9］。甲殼低聚糖還可以作為植物的調節(jié)劑來調節(jié)植物的功能，對抗性基團的開放和關閉影響很大；激活植物本來具有的防御反應，激活抗病基因使其表達，所以甲殼低聚糖還用于制作生物農藥［10］。甲殼低聚糖可以通過甲殼素與甲殼胺的分子結構中糖苷鍵的斷裂來產生低聚糖，常見的方法有酸降解法以及氧化降解法，甲殼低聚糖還能用超聲波對甲殼胺進行降解得到。

微生態(tài)學的研究表明糖尿病腸道的菌群和正常的腸道菌群不同，糖尿病癥狀在臨床上經常通過服用雙歧桿菌制劑和酸奶進行改善［11-12］。有相關研究發(fā)現大腸桿菌能夠產生胰島素樣物質，這種胰島素樣的物質進入血液之后，可快速接觸胰島素靶細胞從而封閉胰島素受體，使體內胰島素接觸靶細胞后發(fā)揮不了作用，導致糖尿病的發(fā)生，在這種狀況下服用能夠促進雙歧桿菌生長的微生態(tài)化學制劑使有益菌快速生長［13-14］。從而發(fā)揮生物特有的拮抗作用，排除能產生胰島素樣物質的大腸桿菌，進而使糖尿病癥狀得到緩解［15-16］。

本實驗的研究結果說明STZ能夠使小鼠血液中的血糖升高，伴乳桿菌與雙歧桿菌等細菌數量明顯下降，說明STZ不僅能使小鼠患糖尿病還會導致小鼠腸道菌群失調［17-18］。對患有糖尿病的小鼠用甲殼低聚糖進行治療21 d后，小鼠癥狀好轉，觀察組小鼠的血糖與模型對照組相比明顯降低，觀察組小鼠的腸道菌群與模型對照組相比雙歧桿菌的數量明顯增多，由此推測甲殼低聚糖通過增加有益菌雙歧桿菌來調節(jié)血糖。

目前臨床上治療糖尿病缺少特效藥物，其治療常常采用飲食調節(jié)等措施緩解［19-20］。本研究表明，甲殼低聚糖能夠促進有益菌（雙歧桿菌）增殖及具有降低血糖的作用。并且甲殼低聚糖還具有淡淡的甜味、沒有免疫原性、良好的溶解性和可以在生物體內降解吸收等優(yōu)點［21］。因此甲殼低聚糖可以作為患者飲料中的甜味添加劑，充分發(fā)揮其在治療糖尿病以及促進腸道菌群生長方面所具有的獨特優(yōu)勢。

綜上所述，甲殼低聚糖可以有效降低鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖以及改變小鼠腸道菌群的數量調節(jié)其功能。

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（編校：王儼儼）

Effect of chitooligosaccharides on blood glucose and intestinal flora in diabetic m ice induced by streptozotocin

WANGMao-rong1，YAO Ping1Δ，ZHANG Bo2

（1.Department of Endocrinology，Minda Hospital Affiliated to Hubei Institute for Nationalities，Enshi445000，China；2.College of Clinical Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the effect of chitooligosaccharides on blood glucose and intestinal flora in diabetic mice induced by streptozotocin（STZ）.Methods45 Kunming strain male mice were selected，and randomly divided into normal control group（n＝14）and model group（n＝31）. Diabetic mice successfully induced by STZ in modelmice were divided into experimental group and model control group（two mice with similar blood glucose levels were divided into two groups respectively）.Themice in experimental group were treated with 600mg／（kg·d）of chitooligosaccharides，gavage，while themice in control group with an equal volume of distilled water.Blood glucose and intestinal flora were detected and compared after continuous gavaging for 21 days.ResultsBlood glucose in experimental group significantly reduced compared with the model control group，and there was a significant difference（P＜0.001）.Intestinal flora（the number of bifidobacteria）in experimental group increased significantly compared with controlmodel group，and therewas a significant difference（P＜0.01）.ConclusionChitooligosaccharides could effectively reduce blood sugar for STZ-induced diabetic mice，and change the number of intestinal flora.

chitooligosaccharides；streptozotocin；diabetic mice

R977.1＋5

A

1005－1678（2014）09－0072－03

國家自然科學基金（81100512）

汪茂榮，女，碩士，副主治醫(yī)師，研究方向：內分泌代謝病，E-mail：qch1821460060＠163.com；姚平，通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：糖尿病發(fā)病機制，E-mail：yp07188301241＠163.com。