TG2在缺氧條件下骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制

蔡文濤，林明俠，夏虹，陳安民，陳麗娟

（1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州510000；2.海南省人民醫(yī)院骨科二區(qū)，海南?？?70311；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院，廣東廣州510000；4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北武漢430030；5南京醫(yī)科大學(xué)研究生院，江蘇南京210029）

TG2在缺氧條件下骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制

蔡文濤1，2，林明俠2，夏虹3Δ，陳安民4，陳麗娟5

（1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州510000；2.海南省人民醫(yī)院骨科二區(qū)，海南?？?70311；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院，廣東廣州510000；4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北武漢430030；5南京醫(yī)科大學(xué)研究生院，江蘇南京210029）

目的探討缺氧條件下，TG2在骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡中的作用，以及TG2是否可通過阻止細(xì)胞色素C的釋放和調(diào)節(jié)Caspase-3的表達(dá)及活性從而抑制細(xì)胞凋亡。方法建立骨肉瘤細(xì)胞體外缺氧培養(yǎng)模型，分成常氧組、單純?nèi)毖踅M、對照siRNA缺氧組、TG2 siRNA缺氧組4組，觀察比較各組在培養(yǎng)不同時相（6、12、24、48、72 h）骨肉瘤MG-63細(xì)胞中TG2、Caspase-3表達(dá)、胞核和胞漿細(xì)胞色素C的變化及細(xì)胞凋亡率。微量滴定板法檢測TG2的活性；半定量RT-PCR方法檢測TG2的mRNA水平；Western blot檢測TG2、Caspase-3及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)情況；免疫組化（SP法）檢測TG2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與常氧組比較，單純?nèi)毖踅M及對照siRNA缺氧組的TG2活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），且隨缺氧時間延長明顯升高；Caspase-3活性未見明顯增加，而Caspase-3及細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率輕度增加。與前3組比較，TG2 siRNA缺氧組在通過轉(zhuǎn)染TG2 siRNA抑制TG2的表達(dá)時，Caspase-3活性及胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡率也顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論缺氧條件下，MG-63骨肉瘤細(xì)胞胞漿的TG2的活性、TG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且隨缺氧時間延長而逐漸增強(qiáng)；TG2可以阻止細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞色素C向胞漿釋放，降低Caspase-3的表達(dá)及活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

骨肉瘤；TG2；細(xì)胞色素C；Caspase-3；細(xì)胞凋亡

惡性腫瘤的形成是腫瘤細(xì)胞無限增殖的結(jié)果，增殖過快必然導(dǎo)致腫瘤局部組織缺氧。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在缺氧條件下可以誘導(dǎo)Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transgiutaminase 2，TG2）的表達(dá)，且TG2參與許多腫瘤細(xì)胞的凋亡過程；研究結(jié)果顯示TG2不僅具有促凋亡作用，而且還有抗凋亡作用，這種矛盾的作用取決于細(xì)胞類型、所受刺激類型及TG2在細(xì)胞內(nèi)的定位和酶活性類型［1］。目前認(rèn)為與骨肉瘤相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑主要有2條：死亡受體配體途徑和線粒體途徑。其中線粒體途徑是通過部分凋亡刺激因子刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C，釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結(jié)合形成多聚體；并募集Caspase-9前體與其形成凋亡小體，Caspase-9被激活并活化下游的Caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。研究表明，在HEK293細(xì)胞，TG2通過消耗Bax、降低Caspase-3和Caspase-9、抑制細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞漿以及在Ca2＋增高時線粒體膜的去極化，從而發(fā)揮抗凋亡的作用［3］。在缺氧的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)同樣的機(jī)制是通過與Caspase-3交叉結(jié)合消耗Caspase-3，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用［4］。這提示在缺氧環(huán)境中，TG2可能通過線粒體途徑參與調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，但是關(guān)于TG2在骨肉瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用及參與調(diào)節(jié)的機(jī)制還未見報道。本研究旨在通過在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞MG-63，通過抑制TG2表達(dá)后檢測細(xì)胞胞核、胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)以及Caspase-3活性改變，探討骨肉瘤MG-63細(xì)胞中TG2的抗凋亡作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、試劑和主要儀器：骨肉瘤細(xì)胞株MG-63由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室惠贈。培養(yǎng)血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibcol公司；鼠抗人TG2、Caspase-3單克隆抗體購自美國San Cruze公司；BCIP／NBT和麗春紅顯色液以及AP堿磷酶標(biāo)記抗小鼠IgG和過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG的二抗購自北京中杉生物技術(shù)公司。FAC Sort流式細(xì)胞儀美國BD公司。

1.1.2 siRNA轉(zhuǎn)染：所有純化的siRNA分子均由美國賽默飛世爾科技公司設(shè)計(jì)合成。TG2轉(zhuǎn)染組的siRNA序列是：正鏈5'-GGGCGAACCACCUGAACAATT-3'，反鏈3'-TTCCCGCUUGGUGGACUUGUU-5'。對照組siRNA序列是：正鏈5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3'，反鏈5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3'。按照DharmaFECT 3試劑盒步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。采用0.25%的胰酶消化、傳代。取二、三代的對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 缺氧模型與分組：細(xì)胞置于CO2缺氧培養(yǎng)箱（5% CO2、95%N2）中、37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，建立缺氧模型。取對數(shù)期的細(xì)胞以5×105個／孔接種至2mL培養(yǎng)液的6孔板中，待細(xì)胞長至90%以上時分為4組：常氧組，細(xì)胞在常氧下培養(yǎng)；單純?nèi)毖踅M，細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；對照siRNA缺氧組，轉(zhuǎn)染對照siRNA后在缺氧培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；TG2 siRNA缺氧組，轉(zhuǎn)染TG2 siRNA后在缺氧培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。于培養(yǎng)不同時段（6、12、24、48、72 h）進(jìn)行相應(yīng)處理，各組每個時間段設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測TG2 mRNA：Trizol法提取總RNA，用分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測。TG2產(chǎn)物序列（5'-3'）上游：GGGGTGAGAGAGGAAAGACC，下游：TGCAGTCTAGGGAGCTGGAT，產(chǎn)物大小為167 bp，退火溫度為58℃。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物，照相后灰度值分析，以目的基因與內(nèi)參基因的比值作為mRNA的相對含量。

1.2.4 TG的活性檢測：采用微量滴定板法來測定細(xì)胞內(nèi)TG活性［5］。收集在常氧或低氧條件下培養(yǎng)0～72 h的細(xì)胞，5-生物素酰氨基戊胺（BP）進(jìn)行標(biāo)記。4℃、20000 g超速離心10 min。以細(xì)胞提取物包被96孔的微量滴定板16 h（4℃），5%牛血清蛋白PBS液室溫下封閉1 h。辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素37℃下孵育45min后，以PBS洗滌，微量滴定板加入鄰苯二胺鹽酸鹽在室溫下顯色5～15min，然后以1mol／L硫酸終止反應(yīng)。顯色后通過微孔板分光光度計(jì)490 nm處測量吸光度（A）來進(jìn)行定量。

1.2.5 細(xì)胞色素C（cytochrome C）水平檢測：細(xì)胞色素C從線粒體釋放的檢測參照Waterhouse等描述的方法［6］。分離出的細(xì)胞胞漿及線粒體成份分別用Western blot方法進(jìn)行檢測和分析。

1.2.6 Caspase活性測定：細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液作用30 min（置于冰上），然后4℃下12000 g離心10 min。將細(xì)胞蛋白提取物（每孔50μg）加入到微量滴定板孔中，每孔中混以100μL的反應(yīng)緩沖液。2mM濃度的Ac-DEVD-pNa用于Caspase-3的測定。采用微孔板分光光度計(jì)405 nm處測量吸光度來進(jìn)行Caspase-3的定量。對硝基苯胺用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來評估確定產(chǎn)物的濃度。

1.2.7 Western blot檢測TG2、BAX及cyt C蛋白：用試劑盒分別提取細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白，考馬斯亮蘭蛋白定量。SDSPAGE電泳分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉、漂洗，然后分別加入TG2、Bax及cyt C一抗（1∶1000稀釋），37℃、2 h，再加入二抗（1∶5000），37℃、1 h，麗春紅顯色。照相后行圖像分析。

1.2.8 免疫組化（SP法）檢測TG2蛋白：制1×1細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長至70%～80%時，加入相應(yīng)的干預(yù)。95%的冷丙酮固定10min，然后按照SP試劑盒說明進(jìn)行染色。以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：根據(jù)切片染色程度分為強(qiáng)、中、弱、無4個等級；同時隨機(jī)觀察6個高倍鏡（10×20）下腫瘤細(xì)胞染色陽性的細(xì)胞個數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞率。

1.2.9 凋亡細(xì)胞檢測（Sub-G1法）：胰酶消化后，取2×105個細(xì)胞，70%的乙醇固定，4℃保存過夜。PBS漂洗，溴化丙啶染色后，F(xiàn)AC Sort流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TG2的活性比較 在常氧組未檢測到原位TG2活性。單純?nèi)毖踅M與對照siRNA缺氧組TG2的活性較常氧組表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01），且每個時間點(diǎn)TG2活性之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單純?nèi)毖踅M及對照siRNA缺氧組比較，TG2 siRNA缺氧組的TG2的活性明顯減弱（P＜0.01，見表1）。

表1 各組TG2活性測定結(jié)果Tab.1 The activity of TG2 in each group

2.2 各組TG2 mRNA表達(dá)水平比較 TG2 mRNA在常氧組僅見低水平的表達(dá)；而在單純?nèi)毖踅M和對照siRNA缺氧組TG2 mRNA較常氧組增高，隨缺氧時間延長，TG2 mRNA水平逐漸提高，并且各個時間段之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與單純?nèi)毖踅M和對照siRNA缺氧組比較，各個時間段TG2 siRNA缺氧組TG2 mRNA水平均顯著降低（P＜0.01，見圖1）。

圖1 各組TG2 mRNA表達(dá)比較*P＜0.01，與常氧組比較；＃P＜0.01，與TG2 siRNA缺氧組比較Fig.1 Comparison of TG2 mRNA expression in each group*P＜0.01，compared with oxygen group；＃P＜0.01，compared with TG2 siRNA hypoxia group

2.3 各組TG2蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示：常氧組未見明顯TG2蛋白表達(dá)；單純?nèi)毖踅M和對照siRNA缺氧組TG2蛋白表達(dá)顯著高于常氧組、TG2 siRNA缺氧組（P＜0.01，見圖2），且表達(dá)強(qiáng)度隨缺氧時間延長明顯遞增。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：MG-63骨肉瘤細(xì)胞的TG2蛋白定位于胞漿。常氧組，TG2蛋白表達(dá)呈陰性。單純?nèi)毖踅M和對照

圖2 Western Blot檢測各組TG2（80KD）蛋白表達(dá)*P＜0.01，與常氧組比較；＃P＜0.01，與TG2 siRNA缺氧組比較Fig.2 TG2 protein expression observed by Western Blot*P＜0.01，compared with oxygen group；＃P＜0.01，compared with TG2 siRNA hypoxia group

siRNA缺氧組TG2陽性細(xì)胞率較常氧組顯著提高（P＜0.01），并且染色強(qiáng)度隨缺氧時間延長明顯增強(qiáng)；而與單純?nèi)毖踅M和對照siRNA缺氧組比較，TG2 siRNA缺氧組的TG2陽性細(xì)胞率顯著減少（P＜0.01，見表2、圖3）。

表2 各組TG2蛋白表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of TG2 protein levels in each group

圖3 免疫組化顯示各組TG2蛋白表達(dá)（48 h，SP，×200）Fig.3 TG2 protein expression observed by immunohistochemical staining（48 h，SP，×200）

2.4 缺氧條件下抑制TG2的表達(dá)對細(xì)胞色素C釋放的影響 Western blot結(jié)果顯示：在常氧組，細(xì)胞胞漿內(nèi)僅有少量的細(xì)胞色素C；在單純?nèi)毖踅M及對照siRNA缺氧組，細(xì)胞胞漿及線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C含量僅受輕微影響；而在TG2 siRNA缺氧組，細(xì)胞胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素C含量明顯增加，而線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C明顯減少（P＜0.01）。提示TG2抑制缺氧條件下骨肉瘤MG-63細(xì)胞色素C由線粒體向細(xì)胞胞漿內(nèi)釋放（見圖4）。

圖4 Western blot檢測各組胞漿及胞核內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白（12kD）表達(dá)*P＜0.01，與常氧組比較；＃P＜0.01，與TG2 siRNA缺氧組比較Fig.4 Protein expression of cytochrome C in cytosol and cyteblast at different hypoxia culture phase detected by Western blot*P＜0.01，compared with oxygen group；＃P＜0.01，compared with TG2 siRNA hypoxia group

2.5 缺氧條件下抑制TG2表達(dá)對細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與常氧組比較，單純?nèi)毖踅M及對照siRNA缺氧組，細(xì)胞凋亡率輕度增加；而在TG2 siRNA缺氧組，細(xì)胞凋亡率較前3組均顯著提高（P＜0.01，見表3）。

表3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptosis rate analyzed by flow cytometry

2.6 缺氧條件下抑制TG2表達(dá)作用下Caspase-3活性及蛋白表達(dá)的變化 與常氧組比較，單純?nèi)毖踅M與對照siRNA缺氧組的Caspase-3活性未見明顯增強(qiáng)；而在TG2 siRNA缺氧組，Caspase-3活性隨著缺氧時間延長逐漸增強(qiáng)（P＜0.01，見表4）。Western blot結(jié)果顯示在單純?nèi)毖踅M，可見弱的Caspase-3蛋白條帶；而在TG2 siRNA缺氧組，Caspase-3蛋白條帶明顯增強(qiáng)（P＜0.01），并且表達(dá)強(qiáng)度隨缺氧時間延長明顯遞增（P＜0.01，見圖5）。

表4 各組細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3的活性比較Tab.4 Comparison of Caspase-3 activity in each group

圖5 Western Blot檢測各組caspase-3蛋白表達(dá)*P＜0.01，與常氧組比較；＃P＜0.01，與TG2 siRNA缺氧組比較Fig.5 Protein expression of caspase-3 observed by Western blot analysis*P＜0.01，compared with oxygen group；＃P＜0.01，compared with TG2 siRNA hypoxia group

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是細(xì)胞無限增殖所致，增殖過快必然導(dǎo)致腫瘤局部組織缺氧和供能與耗能之間的不平衡。在缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋濃度會突然升高，引起線粒體腫脹，并激活鈣依賴相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。但研究發(fā)現(xiàn)缺氧時腫瘤細(xì)胞一系列抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起重要的作用。

TG2也稱作組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（tissue transgiutaminase，tTG），基因定位于20號染色體的q12帶上，全長約32.5 kb。它的蛋白質(zhì)分子量為80 kD，有687個氨基酸殘基，每個單體含有4個獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域。TG2是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶家族中的一個獨(dú)特成員，存在于細(xì)胞的多個部位，包括胞漿、胞核、線粒體、細(xì)胞膜表面以及細(xì)胞外基質(zhì)。它不僅具有Ca2＋依賴的催化蛋白交聯(lián)的活性及GTP依賴的G蛋白的功能，還具有蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性和蛋白激酶的功能［8］。研究證實(shí)TG2參與許多細(xì)胞的凋亡的調(diào)控過程。

但關(guān)于TG2在細(xì)胞凋亡中的作用存在爭議［9］。許多研究結(jié)果都支持TG2的促凋亡作用，在缺氧氧化作用下，高水平的ROS觸發(fā)Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致TG2酶學(xué)活性增強(qiáng)，從而引起細(xì)胞凋亡［10］。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)TG2表達(dá)和凋亡并不是完全一致的。有幾種快速分裂的腫瘤細(xì)胞雖表達(dá)了高水平的TG2，卻沒進(jìn)入凋亡。研究顯示，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的TG2消耗盡后導(dǎo)致細(xì)胞周期停止而發(fā)生細(xì)胞凋亡［11］。最新研究證實(shí)，誘導(dǎo)TG2的表達(dá)可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞的存活［12］。細(xì)胞核內(nèi)突變的TG2（R580A）可以抵消其胞漿內(nèi)的TG2的促凋亡作用［13］。這些研究結(jié)果提示TG2不僅具有促凋亡作用，而且還有抗凋亡作用，這種似乎矛盾的作用取決于細(xì)胞類型、所受刺激類型及TG2在細(xì)胞內(nèi)的定位和構(gòu)型［14］。

為了探討缺氧對MG-63骨肉瘤細(xì)胞TG2表達(dá)的影響，本研究將MG-63骨肉瘤細(xì)胞放在缺氧環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)。免疫組化結(jié)果顯示TG2蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。在缺氧條件下，TG2的活性增強(qiáng)，而且TG2 mRNA水平及蛋白水平表達(dá)都明顯增強(qiáng)，并且隨著缺氧時間的延長逐漸增高。免疫組化提示蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。說明缺氧能夠誘導(dǎo)MG-63骨肉瘤細(xì)胞TG2的表達(dá)，而且主要是增強(qiáng)細(xì)胞漿內(nèi)TG2的活性。通常情況下，細(xì)胞漿內(nèi)TG2通過其轉(zhuǎn)氨基作用來促進(jìn)凋亡，但本研究結(jié)果卻相反。缺氧時，TG2表達(dá)增強(qiáng)，但其細(xì)胞凋亡率增加不明顯；通過轉(zhuǎn)染TG2 siRNA抑制TG2的表達(dá)時，其細(xì)胞凋亡率增加顯著。這表明缺氧誘導(dǎo)MG-63骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)的TG2具有抗凋亡的作用。

為了進(jìn)一步探討在缺氧條件下骨肉瘤MG63細(xì)胞的TG2發(fā)揮抗凋亡的作用途徑，探討了TG2與細(xì)胞色素C以及其調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)系。結(jié)果提示單純?nèi)毖鯒l件下，胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C升高不明顯，但是當(dāng)用siRNA抑制TG2的表達(dá)時，細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞色素C減少，而胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C顯著升高。說明TG2抑制缺氧條件下骨肉瘤MG-63細(xì)胞色素C由線粒體向細(xì)胞胞漿內(nèi)釋放，從而發(fā)揮抗凋亡的作用。

Caspases-3是Caspases家族中重要的效應(yīng)因子，正常情況下以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，沒有活性。在凋亡的早期階段，它被激活；活化的Caspase-3由2個大亞基（17kD）和2個小亞基（12kD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿、胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最新研究證實(shí)，TG2可以與細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及線粒體內(nèi)的一些蛋白形成非共價復(fù)合物。在缺氧條件下，TG2被激活后在胞漿內(nèi)形成的交聯(lián)聚合體可以與Caspase-3形成不溶性復(fù)合物，從而抑制了Caspase-3的活性，抵抗缺氧誘導(dǎo)的凋亡［4］。這種阻止細(xì)胞凋亡的作用是不依賴于TG2轉(zhuǎn)化酶作用，與TG2定位于細(xì)胞漿及其構(gòu)象有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，單純?nèi)毖踅M未見Caspase-3活性表達(dá)增強(qiáng)，但在siRNA轉(zhuǎn)染缺氧組當(dāng)通過轉(zhuǎn)染TG2 siRNA抑制TG2的表達(dá)時，Caspase-3活性及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。說明在缺氧情況下高表達(dá)的TG2可以通過抑制Caspase-3的活性從而發(fā)揮抗凋亡的作用。

綜上所述，缺氧環(huán)境下，MG-63骨肉瘤細(xì)胞胞漿的TG2的活性明顯增強(qiáng)，并且隨缺氧時間延長TG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)；TG2可以阻止細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞色素C向胞漿釋放，并且在胞漿內(nèi)形成的交聯(lián)聚合體可以與Caspase-3形成不溶性復(fù)合物，降低Caspase-3的表達(dá)及活性，從而發(fā)揮抗凋亡的作用，這可能是腫瘤的一個保護(hù)性的逃逸機(jī)制。而通過轉(zhuǎn)染TG2的siRNA抑制TG2表達(dá)，可提高Caspase-3的活性及蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加，這為研究骨肉瘤的治療策略尋找到一個新的切入點(diǎn)。

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（編校：吳茜）

Effect of hypoxia on the expression of TG2 and apoptosis of osteosarcoma cell line MG-63

CAIWen-tao1，2，LIN Ming-xia2，XIA Hong3Δ，CHEN An-min4，CHEN Li-juan5

（1.Graduate School，Southern Medical University，Guangzhou 510000，China；2.Department of Orthopaedics，Hainan Provincial People's Hospital，Haikou 570311，China；3.Department of Orthopedics，Guangzhou General Hospital of Guanzhou Military region，
Guangdong 510000，China；4.Department of Orthopaedic，Tongji Hospital of TongjiMedical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；5.Graduate School，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hypoxia on the expression of TG2 and the relationship between TG2 and apoptosis of osteosarcoma cell line MG-63 under hypoxia environment.MethodsThe hypoxia culturemodelwas established by a hypoxia incubator and divided into four groups.The expression of TG2，cytochrome C，caspase-3 and the rate of apoptosiswere observed at differenthypoxia culture phases.Microtiter plate assay was performed tomonitor intracellular TG2 activity.Caspase-3 activitiesweremeasured using chromogenic substrates and determined bymeasuring the absorbance at405 nm according to the protocol.The reverse transcriotion PCR was used to detect themRNA expression of TG2.The protein level of TG2，cytochrome C and Caspase-3 was observed by Western blot analysis.The rate of apoptosiswere analyzed using flow cytometry.ResultsCompared with the oxygen group，the activity，themRNA level and protein expression of TG2 were increased remarkably with correspondence to the hypoxia time in the pure hypoxia group and the control siRNA hypoxia group.But the activity and protein expression of Caspase-3 didn't change significantly.Similarly，the protein level of cytochrome C in cytosol and the apoptosis rate didn't increasemarkedly.In TG2 siRNA hypoxia group，the Caspase-3 activity and the protein expression of Caspase-3 were all increased significantly（P＜0.01）.Besides，the protein expression of cytochrome C in cytosol and the apoptosis rate rose up significantly（P＜0.01）.ConclusionThe activity，the mRNA level and protein expression of TG2 increases remarkably with correspondence to the hypoxia time in the hypoxia condition.Overexpression of TG2 can inhibite the hypoxia-induced apoptosis through preventing cytochrome C releasing into the cytosol and suppressing caspase-3 activities.

book=2,ebook=7

osteosarcoma；transgiutaminase 2；cytochrome C；Caspase-3；apoptosis

R783.1

A

1005－1678（2014）09－0001－05

國家自然科學(xué)基金（81070437）

蔡文濤，男，博士，研究方向：脊柱外科，E-mail：hpph2472＠yeah.net；夏虹，通信作者，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱外科，E-mail：gzxiahong2＠126.com。