周期蛋白依賴激酶-2表達(dá)對乳腺癌新輔助化療的療效判斷價(jià)值

楊麗萍 羅慶豐 吳毓東 孫正魁 樊 帆

乳腺癌是我國婦女高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%，新輔助治療是其有效治療方法和近期研究熱點(diǎn)，但是新輔助化療總有效率為50% ～ 60%[1]，因此如何預(yù)測新輔助化療有效性對于提高治療效果具有十分重要意義，我們應(yīng)用免疫組化法，檢測新輔助化療該腫瘤患者標(biāo)本的周期調(diào)控蛋白CDK2表達(dá)情況，比較周期調(diào)控蛋白CDK2表達(dá)情況與新輔助化療療效關(guān)系，為乳腺癌規(guī)范的新輔助治療作出有益的探索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

江西省腫瘤醫(yī)院2008年1月至2010年8月收治55例乳腺癌患者，經(jīng)病理檢查確診為浸潤性導(dǎo)管癌，均為女性，年齡33～68歲，平均年齡(50.8±2.6)歲。

1.2 主要試劑及儀器

CDK2購自北京中杉生物科技有限公司，為即用工作液。儀器 Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)型號RM2235，格蘭仕微波爐型號D90D34ESXLRII-Y8。

1.3 治療方法

新輔助化療方案為 “TAC” 方案 (多西紫杉醇75 mg/m2,阿霉素8 mg/m2，環(huán)磷酰胺500 mg/m2)，21天為個(gè)1周期，術(shù)前行2個(gè)周期化療，2周內(nèi)行手術(shù)治療并評價(jià)療效。

1.4 免疫組化檢測

術(shù)前用粗針穿刺經(jīng)過病理組織學(xué)檢查證實(shí)為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，采用MaxvisionTM免疫組化法檢測CDK2表達(dá)，按照免疫組化試劑盒的說明進(jìn)行操作，具體步驟：① 4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③ 3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；④ 抗原修復(fù)：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，微波熱修復(fù)5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤ PBS洗,3 min×2次；⑥ 加入CDK2抗體，4 ℃冰箱12 h；⑦ 復(fù)溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧ 滴加Maxvision二抗試劑，室溫作用1 h；⑨ PBS洗3 min×2次；⑩ DAB光鏡下顯色，蘇木精復(fù)染，封片。光鏡下觀察乳腺癌組織中CDK2蛋白表達(dá)。陽性對照：購自北京中杉生物科技有限公司CDK2蛋白陽性組織片，陰性對照：PBS代替一抗。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

在細(xì)胞核呈棕黃色顆粒沉著者為CDK2陽性。根據(jù)著色強(qiáng)度及著色癌細(xì)胞比例綜合染色結(jié)果：①按切片中細(xì)胞著色有無及深淺評分：無顯色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②根據(jù)著色癌細(xì)胞的比例記分：<5%為0分，5%～25%為1分,26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后計(jì)分=①×②。按積分高低分為：<4分為陰性(-)，≥4分為陽性(+)。根據(jù)新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本判斷療效，按WHO的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]分為臨床完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病進(jìn)展(PD)和無變化(SD),總緩解(OR)=CR+PR,無效(NR)=SD+PD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn)和R×C行列表檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

55例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌CDK2陽性表達(dá)率為70.9%，CDK2陽性表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及腋窩淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移無相關(guān)性 (P>0.05)，并且與腫瘤組織中ER、PR、CerBb-2水平也無相關(guān)性(P>0.05)，CDK2陽性表達(dá)率與乳腺癌組織學(xué)分級無相關(guān)性，見表1。39例CDK2陽性患者新輔助化療總緩解率為61.5%，16例CDK2陰性患者新輔助化療總緩解率為25.0%，兩者總緩解率比較差異具有顯著性意義(P<0.05 ),見表2。

3 討論

表1 CDK2表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系/例

表2 55例乳腺癌中CDK2 表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系/例

乳腺癌近年來發(fā)病率逐漸上升，已成為女性高發(fā)腫瘤，新輔助化療的療效已得到肯定，越來越廣泛的應(yīng)用于臨床，是近期乳腺癌規(guī)范治療中的研究熱點(diǎn)[3]，但目前臨床工作中發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)典的新輔助方案藥物進(jìn)行的新輔助化療其有效率為50%左右，因此探索出乳腺癌對新輔助化療敏感指標(biāo)對于進(jìn)一步提高療效具有重要的意義。多數(shù)學(xué)者采用分子病理標(biāo)記預(yù)測新輔助化療療效，研究結(jié)果不一[4]，本課題選擇檢測乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶2(CDK2)表達(dá)與新輔助化療的關(guān)系，為合理選擇新輔助化療提供理論依據(jù)。

細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶2是控制細(xì)胞分裂中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),對細(xì)胞周期起著核心的調(diào)控作用.通過對細(xì)胞周期蛋白的磷酸化修飾，與不同種類的細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，對細(xì)胞周期的不同時(shí)相進(jìn)行調(diào)控[5]，CDK2在細(xì)胞的生長，增殖中起重要作用，是腫瘤細(xì)胞增殖的限速蛋白，與G1期重要的細(xì)胞周期蛋白E結(jié)合，形成cyclinE-CDK2復(fù)合物[6]，同時(shí)CDK2還可以與cyclinD1，形成cyclinD1-CDK2復(fù)合物，通過促進(jìn)pRB的磷酸化發(fā)揮生物學(xué)活性，是激活DNA復(fù)制系統(tǒng)中的重要組成部分[7]。

本研究選擇乳腺癌55例術(shù)前用粗針穿刺經(jīng)過病理組織學(xué)檢查證實(shí)為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，檢測CDK2標(biāo)記在乳腺癌腫瘤組織粗針穿刺標(biāo)本中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CDK2陽性表達(dá)與乳腺癌預(yù)后及激素敏感治療指標(biāo)ER及PR的表達(dá)率比較結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與Wright 等[8]認(rèn)為CDK2與PR存在協(xié)同表達(dá)研究結(jié)果一致[10]。同時(shí)乳腺癌的CDK2陽性表達(dá)率與CerBb-2標(biāo)記指標(biāo)及其腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Zolochevska等[9]研究CDK2調(diào)控腫瘤細(xì)胞從G1進(jìn)入S增殖期，加速前列腺癌細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移，及其Merrick等[10]研究CDK2參與了G2到M細(xì)胞周期的調(diào)控，抑制和降低CDK2活性，可以導(dǎo)致細(xì)胞G期阻滯，抑制細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞增殖，延緩腫瘤細(xì)胞的生長速度的結(jié)果不一致。值得進(jìn)一步研究CDK2與腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性。新輔助化療療效判定根據(jù)術(shù)后結(jié)合臨床病理學(xué)改變，包括腫瘤大小變化、細(xì)胞核的改變及其腫瘤壞死情況,CDK2陽性組的新輔助化療治療緩解率為61.5%，明顯高于CDK2陰性組25%的緩解率，兩組結(jié)果比較差別具有顯著性意義，CDK2陽性表達(dá)提示腫瘤組織處于快速增殖期G2到M細(xì)胞周期，該時(shí)相采用以細(xì)胞毒性化療藥為主的“TAC”新輔助化療可以殺滅處于增殖期的腫瘤細(xì)胞，取得更加滿意治療效果，本研究表明CDK2陽性表達(dá)對于預(yù)測乳腺癌患者接受以細(xì)胞毒性藥物為主的新輔助化療的療效有一定的參考價(jià)值，為乳腺癌規(guī)范的新輔助治療作出有益的探索。

[1] Shimizu C,Ando M,Kouno T,et al.Current trends and controversies over pre-operative chemotherapy for women with operable breast cancer〔J〕.Jpn J Clin Oncol,2007,37(1):1-8.

[2] Therasse P，Arbuck SG，Eisenhauer EA,et a1.New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors〔J〕.Natl Cancer Inst，200l,92(3)：205-216.

[3] 孫智君.乳腺癌治療現(xiàn)狀〔J〕.重慶醫(yī)學(xué),2010,39(7):772-773

[4] 張 斌，張 強(qiáng)，趙 林，等.乳腺癌新輔助化療療效的評價(jià)及影響因素分析〔J〕.中華腫瘤雜志，2006,28(11):867-870

[5] GoPinathan L，Ratnacaram CK，Kaldis P.Established and novel Cdk/cyclin complexes regulating the cell cycle and development〔J〕.Results Probl Cell Differ,20l1，53：365-389.

[6] 劉海峰，張鳳梅，劉秉慈,等.DNA依賴性蛋白激酶在石英誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2蛋白表達(dá)及細(xì)胞周期改變中的作用〔J〕.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2011,29(4)：241-245.

[7] Liu P,Slater DM,Lenburg M,et al.Replication licensing promotes cyclinD1 expression and G1 progression in untransformed human cell〔J〕.Cell Cycle,2009,8(1):125-136.

[8] Wright RH,Castellano G,Bonet J，et al.CDK2-dependent activation of PARP-1 is required for hormonal gene regulation in breast cancer cells〔J〕.Genes Dev,2012 ，26(17):1972-1983

[9] Zolochevska O，F(xiàn)igueiredo ML.Cell-cycle regulators CDK2、AP l and bicalutamide suppress malignant biological interactions Between Prostate cancer and bone cells〔J〕.Prostate，201l，71(4)：353-367.

[10] Merrick KA,Wohlbold L,Zhang C,et al.Switching cdk2 on or off with small molecules to reveal requirements in human cell proliferation〔J〕.Molecular Cell,2011,42(5):624-636.