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    恒溫冷凍切片對乳腺癌組織中CerbB-2蛋白表達的影響

    2014-09-13 10:01:26陳艷紅劉志良羅慶豐黃傳生
    實用癌癥雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:浸潤性恒溫細胞膜

    高 玟 陳艷紅 劉志良 羅慶豐 黃傳生 涂 侃

    乳腺癌是我國婦女高發(fā)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%。近年來針對HER-2表達的靶向治療方案是主要其輔助治療,是近期乳腺癌規(guī)范治療中的研究熱點[1]。應(yīng)用免疫組化法檢測該腫瘤患者標(biāo)本的CerbB-2蛋白表達情況,是乳腺癌HER-2基因表達重要篩查方法,探索出恒溫冷凍切片后樣本進行檢測CerbB-2蛋白表達是否可行,為CerbB-2蛋白檢測樣本的規(guī)范化處理和乳腺癌的手術(shù)后規(guī)范的輔助治療作出有益的探索。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    收集我院2008年10月-2011年8月期間收治的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者130例,均為女性,年齡37~66歲,平均年齡56.7歲。

    1.2 方法

    1.2.1 恒溫快速冷凍切片方法 取5 mm厚度組織,加入OCT包埋劑,置入冰凍恒溫快速冷凍切片機冷凍5 min,待OCT包埋劑變白硬化后,按5 μm厚度切片,裱在防脫玻璃片,行HE染色,封片,閱片。

    1.2.2 CerbB-2蛋白檢測 采用MaxvisionTM免疫組化法,按照免疫組化試劑盒的操作說明進行。CerbB-2蛋白為工作液,具體步驟:①4 μm連續(xù)切片,裱于涂有APES的載玻片上,70 ℃烤片2 h;②二甲苯脫蠟,梯度酒精入水;③3%過氧化氫室溫孵育30 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶;④抗原修復(fù):切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中,電飯鍋中煮沸5 min,保溫10 min,自然冷卻;⑤PBS洗,3 min×2次;⑥加入已知 CerbB-2蛋白抗體,4 ℃冰箱12 h;⑦復(fù)溫,PBS洗去一抗3 min×2次;⑧滴加Maxvision試劑,室溫作用1 h;⑨PBS洗3 min×2次;⑩DAB光鏡下顯色,蘇木精復(fù)染,封片[1]。光鏡下觀察CerbB-2蛋白在乳腺癌組織中表達。陽性對照:已知 CerbB-2蛋白強陽性乳腺癌組織切片;陰性對照:已知 CerbB-2蛋白陰性乳腺癌組織切片和PBS代替一抗染色切片。

    1.2.3 結(jié)果判斷 細胞膜呈棕黃色顆粒沉著者為CerbB-2蛋白陽性。根據(jù)著色強度及著色癌細胞比例將染色結(jié)果分為-、+、++和+++級:無顯色為-,任何比例的浸潤性癌細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著色為+,浸潤性癌細胞>10%呈現(xiàn)弱至中等程度、完整但不均勻的細胞膜棕黃色著色或浸潤性癌細胞<30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為++,浸潤性癌細胞>30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為+++。

    1.3 閱片

    在普通光學(xué)顯微鏡下,由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對冷凍切片后對應(yīng)的組織和剩余組織常規(guī)切片,的免疫組化切片進行單獨雙盲閱片,記錄診斷結(jié)果,按配對資料比較兩種方法的一致性。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,采用配對資料χ2檢驗和一致性檢驗分析。

    2 結(jié)果

    130例浸潤性導(dǎo)管癌冷凍組織對應(yīng)樣本中42例不表達CerbB-2,33例CerbB-2 表達+,34例CerbB-2 表達++,21例CerbB-2表達 +++;剩余組織常規(guī)切片樣本中56例CerbB-2表達陰性,50例CerbB-2 表達+,19例CerbB-2 表達++,5例CerbB-2表達+++;兩組標(biāo)記結(jié)果比較具有顯著性差異(χ2=134.04,P<0.01),而且兩組CerbB-2陽性表達結(jié)果一致性較差(kappa值=0.39,P>0.05),見表1。

    3 討論

    乳腺癌靶向治療是近期發(fā)展較快且有成效的治療手段,CerbB-2是表皮生長因子受體家族成員之一,定位于人17染色體q21區(qū)帶,是185kD的跨膜糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性,參與多種信號的傳導(dǎo),已有臨床研究顯示[2]:對于CerbB-2受體過表達的乳腺癌患者,采用1種人源化的單克隆抗體類藥物Herceptin是安全有效的藥物,陰性患者Herceptin無效,表明CerbB-2是乳腺癌靶向治療的有效靶點,但是靶向治療藥物常常費用昂貴,因此準(zhǔn)確檢測乳腺癌CerbB-2表達情況對于乳腺癌術(shù)后規(guī)范的輔助治療具有重要意義。

    表1 130例乳腺癌組織中 CerbB-2蛋白表達情況/例

    恒溫快速冷凍切片技術(shù)能快速明確各種腫瘤患者的病理診斷和分級,特別是在手術(shù)過程中尤為重要[3],在乳腺癌患者中顯著提高了診斷準(zhǔn)確率和明確的陰性手術(shù)切緣,在乳腺癌患者規(guī)范化的治療中起到重要作用[4],該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用,但是目前沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)恒溫冷凍切片對于患者CerbB-2蛋白檢測影響的研究,我們選擇了130例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者,對恒溫冷凍切片后對應(yīng)同一組織進行石蠟切片CerbB-2蛋白表達檢測,檢測結(jié)果陽性率為3.80%。同時對該患者剩余組織的石蠟切片進行CerbB-2蛋白檢測,陽性結(jié)果16.20%,兩組結(jié)果差異比較具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義,在恒溫冷凍切片后對應(yīng)組織的石蠟切片中發(fā)現(xiàn)CerbB-2蛋白出現(xiàn)彌散,定位不準(zhǔn)確,陽性強度減弱等現(xiàn)象,因為CerbB-2蛋白是1種跨膜糖蛋白,在快速冷凍情況下,細胞的細胞膜因溫度的短期內(nèi)激烈的改變產(chǎn)生跨膜結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,從而影響陽性表達定位,細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)陽性顆粒。研究表明恒溫冷凍切片對乳腺癌Cerb-2表達影響較大,減低Cerb-2陽性表達,因此工作中應(yīng)該盡量避免使用恒溫冷凍切片后的同一樣本進行乳腺癌Cerb-2表達檢測,以免誤導(dǎo)治療,減少患者不必要的醫(yī)療負擔(dān)和浪費。

    隨著乳腺癌患者規(guī)范化治療的進展,恒溫冷凍切片技術(shù)應(yīng)用和Her-2蛋白的檢測將會越來越廣泛,本研究發(fā)現(xiàn)恒溫快速冷凍切片技術(shù)會減低免疫組化法檢測Her-2蛋白的陽性表達,對于免疫組化法檢測前檢測樣本的標(biāo)準(zhǔn)化處理流程具有重要意義,同時有必要進一步研究恒溫快冷凍切片技術(shù)對FISH法檢測乳腺癌Her-2基因的影響,更為準(zhǔn)確的提供乳腺癌相關(guān)蛋白和基因檢測前樣本處理的規(guī)范化流程[5]。

    [1] Kreancs L,Kreancs T,Stelkovics E,et al.Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections〔J〕.Methods Mol Biol,2010,588:103-119.

    [2] Harries M,Smith L.The development and clinical use of H-erceptin〔J〕.Endocr Relat Cancer,2002,9(2):75-85.

    [3] Winther C,Graem N.Accuracy of frozen section diagnosis:a retrospective analysis of 4785 cases〔J〕.APMIS,2001,119(4):259-262.

    [4] Stewart CJ,Brennan BA,Koay E,et al.Value of cytology in the intraoperative assessment of ovarian tumors:a review of 402 cases and comparison with frozen section diagnosis〔J〕.Cancer Cytopathol,2010,118(3):127-136.

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