噬菌體法檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究

張永勝 張松巖

我國是耐多藥結(jié)核病患者人數(shù)最多的國家之一, 全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告顯示, 我國結(jié)核分枝桿菌的初始耐藥率為28.1%, 繼發(fā)耐藥率為41.1%, 耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)為8.32%［1］, 耐多藥結(jié)核病的情況很嚴(yán)重, WHO已將我國作為全球25個耐多藥結(jié)核病重點國家之一［2］。目前常規(guī)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗不能滿足患者和臨床需要。以噬菌體法進行結(jié)核分枝桿菌檢測及藥物敏感性試驗, 在結(jié)核分枝桿菌檢測和藥敏應(yīng)用研究備受關(guān)注。本研究利用噬菌體法對71株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株分別進行鏈霉素、利福平、異煙肼藥物敏感性進行分析, 觀察與比例法的符合率, 并對肺結(jié)核患者139份臨床痰樣本, 直接進行結(jié)核分枝桿菌檢測應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 71株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來自本所確診的肺結(jié)核患者的痰樣本培養(yǎng)物, 并經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)鑒定為結(jié)核分枝桿菌；139份臨床痰樣本, 來自本所門診臨床確診的肺結(jié)核患者。

1.2 方法

1.2.1 本用NaCl-NaOH去污染, 用15 ml PhageTek MB Medi Plus沖洗, 37℃過夜。(菌液不用去污染, 藥敏試驗加入相應(yīng)藥物, S、R孵育24 h, H孵育48 h, 藥物終濃度分別為S 1 μg/ml、R 2 μg/ml、H 0.2 μg/ml)

1.2.2 感染噬菌體 向標(biāo)本中加100 μl噬菌體, 37℃孵育1 h。

1.2.3 殺死結(jié)核(TB)體外游離的噬菌體 向標(biāo)本中加100 μl強效病毒劑, 充分震蕩, 靜置5 min。

1.2.4 中和 向標(biāo)本中加5 ml Medium plus , 片刻靜置。

1.2.5 表達 向標(biāo)本中加1 ml幫助細胞, 倒入瓶皿中, 加入5 ml融化的瓊膠(不易過熱50～60℃), 迅速旋轉(zhuǎn)混勻, 靜置,37℃過夜。

1.2.6 結(jié)果判定 0～19個菌斑 表明陰性結(jié)果, 說明標(biāo)本中無活著的結(jié)核桿菌；20或更多菌斑 表明陽性結(jié)果, 說明標(biāo)本中有活著的結(jié)核桿菌。藥敏結(jié)果的判定：藥敏培養(yǎng)基菌斑數(shù)<20或藥敏培養(yǎng)基菌斑數(shù)/對照培養(yǎng)基菌斑數(shù)<1%, 判定為敏感；反之判定為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用 10例結(jié)核分支桿菌分別在 102、5×102、103、104、105cfu/ml濃度, (Mcfarland 3.0 濁度相當(dāng)于細菌濃度107cfu/ml)進行噬菌體法檢測結(jié)核菌。該方法檢出最低濃度為 5×102cfu/ml。

2.2 噬菌體法結(jié)核分枝的特異性實驗, 銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等呼吸道常見細菌應(yīng)用噬菌體法檢測均為陰性。牛型分枝桿菌15株、結(jié)核分枝桿菌61株, 進行噬菌體法結(jié)核菌檢測均為陽性。(菌液濃度均為105cFu/ml)其特異性達到100%。

2.3 噬菌體法進行藥物耐藥性分析, 見表1。噬菌體法藥敏同比例法的符合率為90.2%, 分別為S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。

表1 噬菌體法藥敏與比例法藥敏結(jié)果的比較(n, %)

2.4 肺結(jié)核患者臨床痰標(biāo)本139株, 直接進行噬菌體法結(jié)核菌檢測。涂陽培陽標(biāo)本該方法檢出率為96.2%, 涂陰培陽標(biāo)本檢出率為80.0%, 涂陰培陰標(biāo)本檢出率為26.2%。見表2。

表2 139例肺結(jié)核患者臨床痰標(biāo)本的噬菌體法檢測結(jié)果(n, %)

3 討論

利用噬菌體法對結(jié)核分枝桿菌檢測和藥物敏感性實驗具有較高敏感性和特異性, 菌液濃度達到5×102cFu/ml就可檢測出來(涂片檢出濃度為104cFu/ml), 特異性達到100%；其藥物敏感性符合率較高(90.2%)；直接檢測肺結(jié)核患者痰樣本檢出率為62.6%, 大大高出涂片30%的檢出率；而藥物敏感性結(jié)果報告時間(2～4 d)明顯低于改良羅氏絕對濃度法的時間(2～3個月)。由上述研究結(jié)果可看出, 該方法是一種較理想、快速、具有較高敏感性和特異性檢測結(jié)核分枝桿菌和藥物敏感性新方法。

結(jié)核病細菌學(xué)快速檢查歷來是國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注的熱門話題。在國外以分支桿菌噬菌體為基礎(chǔ)的結(jié)核分支桿菌的分類學(xué)、結(jié)核桿菌分子生物學(xué)、結(jié)核病診斷耐藥性分析和新藥篩選等已成為研究熱點［3］。其敏感性可與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)媲美, 而且與培養(yǎng)法符率高。國內(nèi)多家單位也相繼報道了噬菌體法檢測抗結(jié)核藥物藥敏的結(jié)果, 均顯示了較好的應(yīng)用前景［4］。本實驗應(yīng)用噬菌體法對鏈霉素、利福平、異煙肼進行藥物耐藥性分析。噬菌體法藥敏同比例法的符合率為90.2%,分別為S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。與國內(nèi)外報道基本相符。盡管噬菌體法檢測結(jié)核分枝桿菌和藥物敏感性實驗具有快速、敏感、特異等優(yōu)點, 但廣泛應(yīng)用于臨床, 還需在統(tǒng)一操作方法、權(quán)威性的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)、商品化試劑盒等方面進行進一步研究。

［1］ 陳影.噬菌體法檢測痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究,延邊大學(xué), 2011.

［2］ World Health Organization.The Global MDR-TB ＆ XDR-TB Response Plan(2007-2008).Geneva:WHO, 2007:18.

［3］ 林健雄, 王冬敏, 彭東東, 等.噬菌體生物擴增法快速測定結(jié)核分枝桿菌卷曲霉素耐藥性的研究.中國防癆雜志, 2008,30(6):506-509.

［4］ 邊澤源, 何川, 涂少華, 等.噬菌體法直接檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的研究.實驗與檢驗醫(yī)學(xué), 2009, 27(6):145-146.