卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的改良及研究

彭美蓮

浙江省立同德醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江杭州 310012

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來不孕不育癥的發(fā)生率逐年增高，卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）是一項(xiàng)新的輔助生殖技術(shù)[1]，是指應(yīng)用少量促性腺激素或者不經(jīng)過促排卵而直接從卵巢中獲取體內(nèi)未成熟的卵子，經(jīng)過適當(dāng)條件的體外培養(yǎng)，促使卵子成熟并具備受精能力，可以因減少刺激或無刺激而降低常規(guī)體外受精（IVF）中促排卵過程的高額費(fèi)用，降低常規(guī)促排卵藥物引起的卵巢過度刺激綜合征等不良反應(yīng)的發(fā)生率[2-3]。1991年人未成熟卵母細(xì)胞IVM技術(shù)獲得首次成功[4]，此后其發(fā)展一直較為緩慢，而卵母細(xì)胞IVM技術(shù)的一項(xiàng)重要內(nèi)容即為IVM培養(yǎng)液，IVM培養(yǎng)液是IVM技術(shù)發(fā)展的首要前提。目前臨床使用的培養(yǎng)液大多為在常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)液上加入血清等成分，目前還沒有一種價(jià)廉、現(xiàn)成、穩(wěn)定和安全的商品化的IVM培養(yǎng)液。本研究中將小鼠各個(gè)時(shí)期卵母細(xì)胞置入不同配方卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)并進(jìn)行IVF，比較所獲得的卵母成熟率、卵裂率、IVF受精率，研制一種相對(duì)穩(wěn)定的改良培養(yǎng)液，通過對(duì)IVM培養(yǎng)液成分的干預(yù)，改善卵母細(xì)胞IVM的條件，為探索輔助生殖新途徑及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠50只，普通級(jí)，均為健康雌鼠未孕，6～10周齡，體重20 g左右，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予光照14 h，暗適應(yīng)10 h，自由攝食攝水。根據(jù)培養(yǎng)液的不同將50只小鼠分為A組和B組，每組各25只。

1.2 IVM培養(yǎng)液的配制

A組：低糖培養(yǎng)基（DMEM），由美國Gibco公司生產(chǎn)；孕馬血清促性腺激素（PMSG），由寧波第二激素廠生產(chǎn)；人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）由珠海麗珠生物工程有限公司生產(chǎn)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。B組：采用含15%～20%胎牛血清的人類輸卵管液 （HTF）加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)（國產(chǎn)杭州四季青）[4]。

1.3 卵母細(xì)胞的收集

所有小鼠首先給予10 U PMSG（寧波激素制品廠）腹腔注射，46～48 h后收集卵母細(xì)胞。將小鼠斷頸處死后取出卵巢，置于M2操作液沖洗過濾除去脂滴，在顯微鏡下用刺卵針收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），得到小鼠GⅤ期、MⅡ期卵母細(xì)胞[5-6]，移入IM液中進(jìn)行漂洗，再將A、B組移入IVM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)

在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[7]，卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志：拆除顆粒細(xì)胞后以排出第一極體即為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[8]。對(duì)體外和體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)卵胞漿內(nèi)單精子注射受精。觀察受精12～16 h后原核的形成情況，隨后將受精卵移入GM培養(yǎng)基中，每8小時(shí)觀察1次胚胎發(fā)育情況。

1.5 觀察指標(biāo)及計(jì)算方法

①臨床妊娠：指B超下能見到胚囊。②生化妊娠：指發(fā)生在妊娠5周內(nèi)的早期流產(chǎn)，血中可以檢測到HCG升高，大于25 U/mL或者尿妊娠試驗(yàn)陽性，但超聲檢查看不到孕囊，提示受精卵著床失敗，又被稱為“亞臨床流產(chǎn)”。③卵裂胚胎評(píng)級(jí)：1級(jí)胚胎：細(xì)胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片0%～＜10%之間。2級(jí)胚胎：細(xì)胞大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象；碎片10%～＜20%之間。3級(jí)胚胎：細(xì)胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則；胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象；碎片20%～＜50%之間。4級(jí)胚胎：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象；碎片在50%以上。其中1～3級(jí)為正常卵裂胚胎。④優(yōu)質(zhì)胚胎：正常受精來源，第2天為3～5個(gè)細(xì)胞，第3天為7～9個(gè)細(xì)胞，碎片≤20%，卵裂球大致均一且無多核、空泡等現(xiàn)象。⑤可移植胚胎：是指發(fā)育良好的正常卵裂胚胎，可以進(jìn)行移植，為可移植胚胎。其中，正常受精率=（雙原核受精卵數(shù)/成熟卵數(shù)）×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常卵裂胚胎數(shù)）×100%；卵裂率=（正常卵裂胚胎數(shù)/雙原核受精卵數(shù)）×100%；可移植胚胎率=（可移植胚胎數(shù)/正常卵裂胚胎數(shù)）×100%；胚胎種植率=（胎數(shù)/種植胚胎數(shù)）×100%；妊娠率=[（臨床妊娠周期數(shù)+生化妊娠周期數(shù)）]/種植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=（活產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)）×100%[9]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞

在顯微鏡下（400×）不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞的具體發(fā)育情況見圖1。

圖1 不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞

2.2 兩種培養(yǎng)液對(duì)對(duì)卵子成熟及胚胎發(fā)育的影響

A 組小鼠的體外受精率[71.4%（140/196）]、正常受精率[65.7%（92/140）]及卵裂率[89.1（82/92）]與 B 組[67.6%（138/204）、68.1%（94/138）、85.1%（80/94）]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A組小鼠的優(yōu)質(zhì)胚胎率[31.7%（26/82）]和可移植胚胎率[56.1%（46/82）]均優(yōu)于 B 組[25.0%（40/80）、42.5%（34/80）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 見表 1。

表1 兩種培養(yǎng)液對(duì)對(duì)卵子成熟及胚胎發(fā)育影響的比較（%）

2.3 兩種培養(yǎng)液對(duì)妊娠的影響

A組小鼠的妊娠率為23.3%（21/90），低于B組的32.6%（31/95），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；但A組小鼠的活產(chǎn)率及胚胎種植率[17.8%（16/90）、66.7%（30/45）]與 B 組[18.9%（18/95）、68.8%（22/32）]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩種培養(yǎng)液對(duì)妊娠影響的比較（%）

3 討論

卵母細(xì)胞IVM是一項(xiàng)新的輔助生殖技術(shù)，其通過體外培養(yǎng)，使卵泡內(nèi)的未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育成為成熟的第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ）卵母細(xì)胞，受精分裂成胚胎并移植獲得妊娠的技術(shù)[9-10]。卵母細(xì)胞的內(nèi)在質(zhì)量是影像卵母細(xì)胞IVM的重要因素，卵母細(xì)胞的IVM包括核成熟、胞質(zhì)成熟、胞膜成熟[11]，細(xì)胞核完成第一次減數(shù)分離排出的極體即為核成熟，第一極體是判斷核成熟的重要依據(jù)。卵母細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育過程中，胞質(zhì)成熟和核成熟是同步完成的，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)后可恢復(fù)減數(shù)分裂并達(dá)到MⅡ期，可以受精、發(fā)育為正常胚胎[12]。與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比較，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞可能并不能中分的成熟，卵母細(xì)胞的成熟依賴于特定時(shí)段特定基因的表達(dá)[13]，卵母細(xì)胞的成熟受磷酸化/去磷酸化及蛋白質(zhì)合成/降解等作用的影響[14]。目前關(guān)于卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究較多，但是各個(gè)研究報(bào)道的結(jié)果的差異較大，說明IVM技術(shù)尚未完全成熟，仍然需要進(jìn)一步地改進(jìn)和完善。雖然有大量的關(guān)于人類和哺乳類未成熟卵母細(xì)胞IVM的機(jī)制和能力的研究[15-16]，但是IVM卵母細(xì)胞的妊娠率仍然比常規(guī)的體內(nèi)成熟卵IVF的妊娠率低，說明IVM技術(shù)還有待進(jìn)一步深入研究。

如何創(chuàng)建適合卵子發(fā)育的體外培養(yǎng)環(huán)境是完善未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的關(guān)鍵[17]，目前雖然有大量關(guān)于人類和哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞IVM的研究[18]，但是其受精后的妊娠率均較低，效果不甚理想，說明卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的成熟過程在體內(nèi)是同步進(jìn)行的，可以進(jìn)一步闡明哺乳動(dòng)物卵及胚胎在體外生長代謝時(shí)所需的營養(yǎng)條件。人類IVM技術(shù)專門針對(duì)一些卵子成熟障礙的不孕患者，特別是頑固的多囊卵巢綜合征、卵巢過度刺激征、卵泡發(fā)育遲緩的患者，將此類患者未成熟的卵母細(xì)胞取出，在體外進(jìn)行培養(yǎng)、受精，然后將胚胎移植到母親子宮腔內(nèi)生長，可能避免藥物和治療的副作用，減少費(fèi)用，降低促排卵的風(fēng)險(xiǎn)。卵泡的大小和卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的成熟具有重要影響，卵泡的大小在一定程度上反映了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，正常的生理狀態(tài)下只有優(yōu)勢卵泡可以排卵，多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，小卵泡中卵母細(xì)胞卵裂率和成熟率較低；多層卵丘包裹的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力較強(qiáng)，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有重要的意義，可能于一些生長因子可以通過兩者的縫隙連接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)。

培養(yǎng)液是卵母細(xì)胞IVM技術(shù)發(fā)展的一項(xiàng)重要內(nèi)容，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液有組織培養(yǎng)基（TCM-199）、Ham F10、B2、Eagle 基本 DMEM、HTF 等[19]。體外基礎(chǔ)培養(yǎng)液的選取對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的高低有重要的影響，人類IVM的培養(yǎng)基通常加入一些生長因子、激素或者卵泡液，最常用的是胎兒胚胎血清和臍帶血清[20]。目前關(guān)于人類卵母細(xì)胞培養(yǎng)基成分的報(bào)道少見，可能于GⅤ期卵母細(xì)胞的提取難度較大有關(guān)。有研究報(bào)道顯示[21]，激活素和抑制素也具有促進(jìn)細(xì)胞核成熟和成熟卵母細(xì)胞的受精的作用。生長因子、激素或者卵泡液可顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟率和卵裂率。

在IVM培養(yǎng)期間，人類卵母細(xì)胞對(duì)促性腺激素十分敏感，加入卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素能夠促進(jìn)人類卵母細(xì)胞的成熟和卵裂，F(xiàn)SH能夠加速細(xì)胞核的成熟，減少染色體異常的發(fā)生。另外，添加生長激素GH可以促進(jìn)卵泡細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞調(diào)亡。在培養(yǎng)基中加入5 mmol的視黃醛能夠增加卵裂率，應(yīng)用抗氧化劑有利胚胎的發(fā)育。但目前還沒有一種現(xiàn)成、價(jià)廉、穩(wěn)定和安全的商品化的IVM培養(yǎng)液提供。由此很有必要研制一種改良的IVM培養(yǎng)液并能夠推廣使用。

本研究結(jié)果顯示，A組培養(yǎng)液的優(yōu)質(zhì)胚胎率和可移植胚胎率均優(yōu)于B組，A組小鼠的妊娠率為23.3%，低于B組的32.6%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明A組所有培養(yǎng)液的應(yīng)用前景較佳。在卵母細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，游離卵泡常出現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象，抑制卵泡的生長，當(dāng)較大卵泡在形成腔卵泡而被破壞或退化后，其緊鄰的較小卵泡有些仍可恢復(fù)生長發(fā)育能力，繼續(xù)生長，直至形成囊腔，說明卵泡之間存在一種相互作用機(jī)制，仍有待于深入研究。

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