慢性阻塞性肺病大鼠氣道Clara細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分泌蛋白表達(dá)的變化

李現(xiàn)東 韓紀(jì)昌 李 磊 賈宗嶺 李紅兵 吳雪雁

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院呼吸科,河南 開(kāi)封 475000)

慢性阻塞性肺病(COPD)的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，COPD動(dòng)物模型的，非纖毛上皮細(xì)胞及其分泌蛋白的變化越來(lái)越引起人們的重視。非纖毛上皮細(xì)胞,也稱(chēng)Clara細(xì)胞,主要分布于細(xì)支氣管,具有多種功能。Clara細(xì)胞是支氣管上皮損傷修復(fù)的祖細(xì)胞，是細(xì)支氣管上皮的前體細(xì)胞,可代謝細(xì)胞色素P-450單氨氧化酶,分泌表面活性物質(zhì)。Clara細(xì)胞分泌的一種10 kD蛋白(CC10),近年來(lái)被認(rèn)為在小氣道的防御機(jī)制中起重要作用,如可結(jié)合多氯聯(lián)苯〔1〕;具有抑制磷脂酶A2、抗蛋白酶活性作用〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M吸煙導(dǎo)致人COPD發(fā)生的病理生理過(guò)程,采用煙草霧吸入誘導(dǎo)COPD大鼠模型,觀(guān)察COPD發(fā)病過(guò)程中Clara細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及小氣道CC10表達(dá)的變化,并測(cè)定氣道阻力及呼吸系統(tǒng)總順應(yīng)性,進(jìn)而探討Clara細(xì)胞在COPD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1COPD大鼠模型的制作 自制有機(jī)玻璃染毒箱,70 cm×60 cm×60 cm,上方設(shè)有一直徑1.2 cm的通氣孔;吸煙小室大小約3 cm×1.5 cm×1.5 cm,每次吸煙時(shí)同時(shí)將2支點(diǎn)燃的香煙的過(guò)濾嘴部分與吸煙小室相連,煙霧經(jīng)改良的注射器裝置由吸煙小室吸出后注入染毒箱內(nèi)。香煙采用廣東中煙集團(tuán)生產(chǎn)的硬盒雙喜牌過(guò)濾嘴香煙,含焦油13 mg,尼古丁1.3 mg，一氧化碳1.4 mg。大鼠每日吸煙3次,每次持續(xù)吸入新鮮的香煙煙霧30 min,兩次吸煙間隔4 h。第1天每次吸煙6支,第2、3天每次吸煙8支,第3天以后每次吸氧10支。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠36只,體重(250±20)g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,根據(jù)實(shí)驗(yàn)將大鼠隨機(jī)分為3組,每組各12只:分別設(shè)為：A組：大鼠吸煙至第3周末處死，B組：大鼠吸煙至第6周末處死，C組,大鼠不吸煙,飼養(yǎng)至7 w末處死。

1.3呼吸功能測(cè)定 采用小動(dòng)物呼吸功能測(cè)定儀(北京宣武醫(yī)院研制),測(cè)定氣道阻力(呼氣時(shí))及呼吸系統(tǒng)總順應(yīng)性。

1.4標(biāo)本制作及免疫組化染色 呼吸功能測(cè)定結(jié)束后將所有大鼠行腹主動(dòng)脈放血處死。取大鼠右下肺組織固定于10%福爾馬林,進(jìn)行石蠟切片,部分行常規(guī)HE染色,另有一部分標(biāo)本經(jīng)常規(guī)APES處理后進(jìn)行免疫組化染色,免疫組化染色使用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶(S-P)方法。試劑采用廣州達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的SP-9706試劑盒。免疫染色陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。取右上肺新鮮組織立即固定于2.5%戊二醛溶液,按電鏡常規(guī)行標(biāo)本制備,半薄切片定位終末細(xì)支氣管后做超薄切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色,JEM-100CXⅡ型透射電鏡觀(guān)察。

1.5免疫組化染色判定 每例選擇4個(gè)終末或呼吸性細(xì)支氣管,計(jì)數(shù)CC10陽(yáng)性細(xì)胞占支氣管上皮細(xì)胞的百分率,400倍鏡下觀(guān)察。CC10陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)頂端呈黃色→棕黃色,根據(jù)著色程度將陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度定為3級(jí)，+、、分別積1、2、3分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組呼吸功能及CC10表達(dá)的比較 見(jiàn)表1。A、B、C三組氣道阻力、肺順應(yīng)性、CC10阻性細(xì)胞百分比及積分均有顯著差異(P<0.05)。

表1 各組呼吸功能及CC10表達(dá)的比較±s，n=12)

2.2Clara細(xì)胞的分布 免疫組化顯示，Clara細(xì)胞主要分布于終末細(xì)支氣管和呼吸性細(xì)支氣管(表2)。

表2 各組大鼠的Clara細(xì)胞分布及細(xì)胞數(shù)±s)

2.3光鏡觀(guān)察 C組:氣管、支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常。A組:支氣管上皮增生,部分支氣管上皮呈復(fù)層排列,支氣管壁出現(xiàn)“套袖狀”單核細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡囊擴(kuò)張。吸B組:大鼠支氣管上皮細(xì)胞明顯脫落,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,部分肺泡壁變薄、斷裂、呈飄帶樣改變,肺泡融合、肺泡腔擴(kuò)大。

2.4電鏡觀(guān)察 C組:大部分細(xì)胞呈橢圓形突入管腔,表面有短小微絨毛,為Clara細(xì)胞,占細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的62%。Clara細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)多量有膜包繞的顆粒,呈圓形或橢圓形,電子密度均勻,部分電子密度較低的顆粒周邊有空暈或致密核心。少數(shù)顆粒見(jiàn)指紋狀結(jié)構(gòu)。個(gè)別顆粒呈胞吐?tīng)顟B(tài)。Clara細(xì)胞內(nèi)有多量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及較多線(xiàn)粒體。纖毛細(xì)胞較少,纖毛排列整齊。A組大鼠: Clara細(xì)胞占細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的47%,胞質(zhì)內(nèi)的顆粒減少,含低電子密度顆粒的Clara細(xì)胞較多。B組大鼠:Clara細(xì)胞占細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的41%,部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。纖毛細(xì)胞增多,纖毛紊亂、脫落,變窄的管腔內(nèi)充以脫落纖毛及細(xì)胞碎片。

2.5氣道上皮細(xì)胞CC10陽(yáng)性率與呼吸功能相關(guān)性 氣道上皮細(xì)胞CC10陽(yáng)性率與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)(R=-0.694，P<0.01),與動(dòng)態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應(yīng)性呈正相關(guān)(R=0.732，P<0.01)。

3 討 論

COPD特點(diǎn)是小氣道阻力增高、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前是呼吸系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一〔5～8〕。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),短期吸入臭氧(2 w)導(dǎo)致Clara細(xì)胞損傷、壞死,長(zhǎng)期吸入臭氧(20個(gè)月)導(dǎo)致大鼠終末細(xì)支氣管Clara細(xì)胞數(shù)量增加、Clara細(xì)胞顆粒體積增大、胞質(zhì)內(nèi)CC10含量增加,該變化被認(rèn)為是氣道上皮細(xì)胞對(duì)氧化劑耐受性的表現(xiàn)〔2,9～11〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),吸煙者氣道上皮細(xì)胞中Clara細(xì)胞數(shù)量減少,末梢血CC10含量下降。以上研究提示Clara細(xì)胞在COPD發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用〔12,13〕。

本研究結(jié)果提示大鼠長(zhǎng)期吸煙可使大鼠出現(xiàn)慢性支氣管炎、肺氣腫的病理改變,氣道阻力增加、動(dòng)態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應(yīng)性下降;吸煙導(dǎo)致Clara細(xì)胞受損,其數(shù)量減少,CC10表達(dá)下降,電鏡觀(guān)察顯示其超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化,吸煙3 w出現(xiàn)氣道上皮CC10表達(dá)下降,電鏡觀(guān)察顯示含低電子密度顆粒的Clara細(xì)胞較多,此種變化的意義尚不清楚。上皮細(xì)胞的損傷脫落是COPD患者氣道的一個(gè)重要病理改變,氣道上皮損傷修復(fù)延遲參與氣道炎癥過(guò)程。在氣道上皮損傷修復(fù)過(guò)程中,局部合成較多的細(xì)胞因子,促進(jìn)氣道炎癥與氣道重構(gòu)。本研究提示Clara細(xì)胞在參與COPD氣道炎癥上皮損傷修復(fù)過(guò)程中,其CC10分泌減少;同時(shí),Clara細(xì)胞減少導(dǎo)致上皮損傷修復(fù)延遲,成纖維細(xì)胞遷徙至上皮下發(fā)揮替代修復(fù)作用,促進(jìn)氣道重構(gòu)。

本研究結(jié)果提示COPD時(shí)CC10降低削弱了對(duì)PLA2的抑制,促進(jìn)LT的產(chǎn)生,參與氣道重構(gòu)。由于Clara細(xì)胞參與表面活性物質(zhì)合成,COPD大鼠Clara細(xì)胞數(shù)量減少、氣道上皮細(xì)胞CC10表達(dá)下降,可導(dǎo)致小氣道內(nèi)表面活性物質(zhì)減少、局部抗炎作用減弱,引起氣道阻力增高、動(dòng)態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應(yīng)性下降,最終導(dǎo)致了COPD的發(fā)生〔14～16〕。

本研究通過(guò)煙霧吸入誘導(dǎo)的COPD大鼠模型,證實(shí)了Clara細(xì)胞及其分泌蛋白與COPD病變密切相關(guān)。但考慮到本研究中大鼠例數(shù)較少,觀(guān)察時(shí)間較短，得出的結(jié)論尚不夠客觀(guān)，所以應(yīng)加大樣本量再進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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