環(huán)孢素A對大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響

容瓊文 蘇慶杰 陳志斌 王淑榮 蔡美華 王 埮 陳 蓉

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570102)

神經(jīng)元凋亡是腦缺血損傷過程中神經(jīng)元死亡的一種主要形式，尤其是在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中作用顯著。目前已知調(diào)控細(xì)胞凋亡的三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路〔1〕。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的樞紐。在細(xì)胞凋亡中，MPTP起到重要作用，神經(jīng)元缺血/再灌注(I/R)損傷后，神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜損傷，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C(CytC)從線粒體釋放入胞質(zhì)，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔2〕。本研究觀察神經(jīng)細(xì)胞擬明確環(huán)孢素A(CsA)是否具有抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷的作用，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 出生24 h內(nèi)雄性SD大鼠，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑 CsA購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、0.25%胰蛋白酶、Neuronbasal培養(yǎng)液、B-27添加劑購自GIBCO公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)購自武漢博士德生物公司；L-多聚賴氨酸、阿糖胞苷(Ara-c)購自Sigma 公司。細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、兔單克隆Caspase-3激活型抗體購自碧云天公司；CytC試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3主要儀器 熒光顯微鏡、Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀、倒置相差顯微鏡：OLYMPUS公司(日本)；流式細(xì)胞儀：FACSCLSR，Becton-Dickton(美國)。

1.2實驗方法

1.2.1SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 取出生24 h的SD大鼠，低溫麻醉后75%乙醇消毒，無菌條件下取腦組織，將腦組織放置于低溫?zé)o菌PBS液中，剪除腦膜、血管，低溫PBS液沖洗3次，剪成1 mm的碎塊，加入0.25%胰酶在37℃溫箱內(nèi)消化10 min，之后加入完全培養(yǎng)液終止消化，滴管吹打混勻后800 r/min離心6 min，棄上清，再加完全培養(yǎng)液6 ml，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心6 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，靜置15 min，按1×106/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)(培養(yǎng)瓶預(yù)先給予多聚賴氨酸包被)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為維持培養(yǎng)液，第3天開始更換為含有阿糖胞苷的維持培養(yǎng)液繼續(xù)作用48 h，然后再換回維持培養(yǎng)液，之后每次換半量。接種第7天可見神經(jīng)元突起連接成網(wǎng)，使用標(biāo)記有綠色免疫熒光的NSE鑒定神經(jīng)元。

1.2.2實驗分組 原代神經(jīng)元培養(yǎng)至7 d，分組：(1)對照組；(2)I/R組；(3)I/R+CsA組(按CsA濃度不同又分為4個亞組，分別為：CsA1組，細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入1 μmol/L CsA；CsA5組，細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入5 μmol/L CsA；CsA10組，細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入10 μmol/L CsA；CsA20組，細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入20 μmol/L CsA，各亞組的CsA均在造I/R模型前2 h加入)。

1.2.3大鼠神經(jīng)細(xì)胞體外模擬I/R模型的建立 取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元，換入無糖Earles液，將神經(jīng)元培養(yǎng)瓶置于含有95%N2和5%CO2的混合氣體的缺氧罐內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)密閉6 h，取出神經(jīng)元培養(yǎng)瓶，換入維持培養(yǎng)液，放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗〔3～5〕。

1.2.4MTT比色法檢測CsA對I/R神經(jīng)細(xì)胞活力的影響 取上述各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為1×106/ml，按每孔100 μl接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入MTT 15 μl(5 mg/dl)，37℃孵育4 h，鏡下觀察形成紫色針狀結(jié)晶，棄去上清，每孔加入DMSO 100 μl，室溫下放置10 min。待鏡下觀察紫色結(jié)晶全部溶解后，以Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀測定MTT吸光度值，檢測波長為570 nm。

1.2.5Annexin V -FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，操作方法參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進行，上機檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western印跡檢測各組胞質(zhì)CytC及活性Caspase-3蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)的各組細(xì)胞，提取胞質(zhì)蛋白(參照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒說明書進行)。提取后行蛋白定量，取10 μg樣品，加入等體積上樣緩沖液混勻，100℃煮2 min，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h后加入一抗4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1 h，洗滌，顯色，曝光。

2 結(jié) 果

2.1原代大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 出生24 h的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7天，可見神經(jīng)元胞體圓滿，胞核顯示明顯，細(xì)胞突起長，相互間連接成網(wǎng)(圖1)。免疫熒光染色顯示神經(jīng)元胞質(zhì)及突起呈NSE陽性綠色熒光(圖2)。

圖1 培養(yǎng)至7 d的神經(jīng)元(×200)圖2 神經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定

圖3 Westrn 印跡檢測各組CytC及活性Caspase3蛋白表達(dá)

2.2CsA對I/R后神經(jīng)元的作用 對照組細(xì)胞在未加任何干預(yù)的情況下，其在570 nm處的光密度值(OD值)為0.849±0.034；I/R組的OD值明顯降低，為0.648±0.030(P<0.01)；I/R+CsA各亞組均可見OD值升高，CsA1、5、10、20組分別為0.684±0.008、0.731±0.004、0.780±0.009、0.787±0.004，與I/R組差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

2.3聯(lián)合Annexin V-FITC和PI染色檢測各組細(xì)胞凋亡率 正常培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡率為4.8%,I/R組為20.1%，與對照組相比差異明顯(P<0.01)；CsA1組為17.51%，CsA5組為13.25%，CsA10組為10.63%，CsA20組為6.78%，各CsA組與I/R組相比凋亡率均減少(P<0.05)。

2.4Western 印跡法檢測各組神經(jīng)元CytC及活性Caspase-3蛋白表達(dá) 對照組神經(jīng)元CytC及活性Caspase-3蛋白有少量表達(dá)，經(jīng)I/R處理后兩者表達(dá)均明顯增多，分別為對照組的1.3及1.5倍(P<0.05)；而預(yù)先用CsA干預(yù)的各組細(xì)胞，胞質(zhì)CytC及活性Caspase-3蛋白的量隨著濃度的增高逐漸減少(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

線粒體是重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞生產(chǎn)能量的重要場所，氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、能量平衡等過程均在線粒體中進行。維持線粒體功能的必要條件是線粒體膜的通透性和流動性〔6〕。

在維持線粒體功能中，線粒體通透性轉(zhuǎn)換起關(guān)鍵作用，是掌控線粒體內(nèi)外信息交流的樞紐,其是通過MPTP實現(xiàn)的。MPTP主要系由線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)、線粒體內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)運酶(ANT)和線粒體基質(zhì)的CsA受體D(CyP-D)組成的蛋白復(fù)合體，位于線粒體內(nèi)外膜之間〔7〕。此外,某些線粒體膜蛋白也可能與此通道構(gòu)成有關(guān)，如抗凋亡蛋白Bcl-2和苯二氮卓類受體、線粒體肌酸激酶等〔8〕。

線粒體在生理狀態(tài)下為細(xì)胞提供能量主要依靠線粒體內(nèi)外膜之間保持一定的電化學(xué)勢能，促使氧化磷酸化合成ATP。正常狀態(tài)下，MPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，線粒體內(nèi)膜僅選擇性地通過某些代謝底物和離子，對其他物質(zhì)都沒有通透性，線粒體外膜允許分子量10 kD以下的呼吸鏈底物自由通過，這就有利于在線粒體內(nèi)外產(chǎn)生電勢差，形成穩(wěn)定的線粒體膜電位。

在缺血缺氧的應(yīng)激條件下，線粒體內(nèi)膜可自由通過分子量小于1.5 kD的分子物質(zhì)，升高線粒體基質(zhì)滲透壓，出現(xiàn)基質(zhì)腫脹，線粒體外膜損傷，線粒體膜電位失衡，MPTP開放。同時，細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運異常，引起線粒體內(nèi)Ca2+超載,Ca2+通過與MPTP的結(jié)合位點,引起MPTP開放,導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜電位喪失,線粒體腫脹、外膜破裂，兩者發(fā)生的結(jié)果使線粒體外膜受到破壞，導(dǎo)致位于線粒體膜間隙的CytC和AIF等線粒體凋亡因子釋放。其次，線粒體內(nèi)膜允許質(zhì)子自由通過，這使氧化磷酸化過程解耦聯(lián),ATP水解大于合成。同時，線粒體膜電位的破壞也加速線粒體能量耗竭。當(dāng)MPTP開放后，不足以削弱整個細(xì)胞產(chǎn)生ATP。因此，CytC和AIF等線粒體凋亡因子釋放以及ATP的變化，使Caspases-9前蛋白被激活成Caspases-9活性形式,后者繼而激活Caspase-3,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔9,10〕。

本實驗中，大鼠神經(jīng)細(xì)胞I/R后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時胞質(zhì)內(nèi)CytC蛋白含量增高及活性Caspase-3表達(dá)升高。CsA抑制MPTP的開放是通過和CyP-D結(jié)合〔11〕，從而阻止線粒體內(nèi)容物釋放，使細(xì)胞凋亡延緩。CsA能明顯地減輕心、肝、腦、腎等臟器I/R過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔12〕。目前有關(guān)CsA對體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞I/R后凋亡的影響尚無報道，本實驗結(jié)果表明，CsA各亞組與I/R組相比，細(xì)胞凋亡率明顯下降,胞質(zhì)內(nèi)CytC蛋白及活性Caspase-3表達(dá)顯著降低，證明CsA對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞I/R損傷有保護作用，該作用可能是源于CsA對神經(jīng)細(xì)胞MPTP開放的抑制作用。

4 參考文獻

1Arden N,Majors BS,Ahn SH,etal.Inhibiting the apoptosis pathway using MDM2 in mammalian cell cultures〔J〕.Biotechnol Bioeng,2007;97(3):601-14.

2Kim JS,He L,Lemasters JJ.Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis〔J〕〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2003;304(3):463-70.

3Goldberg MP,Hoi DW. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture:calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury〔J〕. Neuronscience,1993;13: 3510-24.

4Meloni BP,Majda BT,Knuckey NW. Establishment of neuronal in vitro models of ischemia in 96-well microtiter strip-plates that result in acute progressive and delayed neuronal death〔J〕. Neuroscience,2001;108(1):17-26.

5司徒鎮(zhèn)強,吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)〔M〕.第2版.西安:世界圖書出版公司，2007:200-1.

6江時森,程訓(xùn)民.線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在糖尿病心肌病中的作用〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2010;35(7):785-7.

7Javadov S,Karmazyn M.Mitochondrial permeability transition pore opening as an endpoint to initiate cell death and as a putative target for cardioprotection〔J〕.Cell Physiol Biochem，2007,20(1-4):1-22.

8Krestinina OV,Grachev DE,Odinokova IV,etal.Effect of peripheral benzodiazepine receptor(PBR/TSPO) ligands on opening of Ca2+-induced pore and phosphorylation of 3.5-kDa polypeptide in rat brain mitochondria〔J〕.Biochemistry (Mosc)，2009;74(4):421-9.

9Bernardi P,Krauskopf A,Basso E,etal.The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target〔J〕.FEBS J，2006;273(10):2077-99.

10Nakagawa T,Shimizu S ,Watanabe T,etal. Cyclophilin D dependent mitochondrial permeability transition regulates som e necrotic but not apoptotic cell death〔J〕. Nature,2005;434(7033):652-8.

11Halestrap AP.Mitochondrial calcium in health and disease〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1787(11):1289-90.

12Xie JR,Yu LN. Cardioprotective effects of cyclosporine A in an in vivo model of myocardial ischemia and reperfusion〔J〕.Acta Anaesthesiol Scand,2007;51(7):909-13.