瑣瑣葡萄齊墩果酸對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

袁 芳 劉 濤 馬 龍

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011)

中藥及保健功能性食物預(yù)防和治療阿爾茨海默病(AD)的作用日益受到重視〔1〕。國內(nèi)外研究顯示，葡萄提取物能預(yù)防AD，對(duì)原花青素、白藜蘆醇等葡萄提取物的抗癡呆作用報(bào)道較多，但未見對(duì)葡萄提取的三萜類物質(zhì)研究〔2～4〕?，崿嵠咸褳槠咸芽破咸褜僦参锷狡咸?，我國主產(chǎn)于新疆吐魯番、和田、鄯善等地，是醫(yī)藥文獻(xiàn)如《神農(nóng)本草經(jīng)》、《維吾爾藥志》等所記載的藥用葡萄品種之一。齊墩果酸(OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，在瑣瑣葡萄提取的總?cè)浦械钠骄繛?5.52%。本研究通過建立AD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)瑣瑣葡萄提取的總?cè)凭哂锌笰D作用〔5〕。本研究利用Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，制備具有擬AD樣病理變化的體外細(xì)胞模型，研究OA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1藥品試劑與儀器 瑣瑣葡萄購自新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番維藥市場，新疆藥物研究所鑒定。課題組提取OA，二甲亞砜(DMSO)溶解，0.22 μm尼龍濾膜過濾除菌，-20℃避光保存，臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋，DMSO濃度低于1‰。DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Aβ25～35(Sigma公司)；CCK-8檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物研究所)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BioVision)；Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量(Invitrogen)。垂直流超凈化臺(tái)(美國Thermo公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(BD LSRⅡ)，倒置熒光顯微鏡(LEICA DFC490，德國)，實(shí)時(shí)PCR儀(7700型，美國ABI公司)。

1.2Aβ25～35誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞損傷模型的建立 PC12細(xì)胞(高分化)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，置37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液，3～4 d傳代。取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，計(jì)數(shù)后5×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)至貼壁后，分別加入0、10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35(1 mmol/L的Aβ25～35置于37℃老化7 d，臨用前稀釋)，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞的存活率。

1.3CCK-8試劑盒測定細(xì)胞存活率 對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞5×104/ml接種于96孔板，保護(hù)組加入OA，終濃度為20、40、80 μg/ml，預(yù)處理4 h后，除對(duì)照組外加入Aβ25～35，使之終濃度為20 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度，計(jì)算PC12細(xì)胞存活率。

1.4LDH檢測 Aβ25～35誘導(dǎo)24 h后，分別收集各組細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書操作，計(jì)算各組細(xì)胞上清液LDH活性。

1.5SOD、MDA檢測 按上述方法收集各組細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書操作，分光光度計(jì)測定吸光度，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，按上述方法分組并培養(yǎng)細(xì)胞，將各組的細(xì)胞消化后收集，1 000 r/min離心5 min，用冷DMEM洗滌2次，結(jié)合緩沖液中重懸成單細(xì)胞懸液，密度為1×106/ml，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，輕輕振蕩、混勻，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NF-κB p65基因表達(dá) 細(xì)胞接種6孔板，按上述方法分組培養(yǎng)細(xì)胞，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)分析RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA 加入熒光定量PCR反應(yīng)體系。根據(jù)GenBank序列，引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列。所用的引物及內(nèi)參β-actin引物由鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。數(shù)據(jù)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理，樣本的相對(duì)定量=目的基因含量/內(nèi)參基因含量，計(jì)算待測組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1Aβ25～35對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響 終濃度分別為10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35與PC12細(xì)胞作用24 h后，與對(duì)照組(100%)細(xì)胞比較，細(xì)胞存活率逐漸降低，其IC50約為20 μmol/L。本課題后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 μmol/L的Aβ25～35作用PC12細(xì)胞24 h制備AD細(xì)胞模型。

2.2OA對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞存活率下降為68.03%(P<0.01)；與模型組相比，OA保護(hù)組細(xì)胞存活率有明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.3OA對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH、SOD、MDA的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的LDH活性明顯增加、SOD活性明顯下降、MDA含量增高(P<0.01)；與模型組相比，OA組細(xì)胞LDH活性明顯降低、SOD活性增加、MDA含量降低(P<0.01)。見表2。

2.4OA對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(4.58%)明顯低于模型組凋亡率(35.18%)(P<0.01)；與模型組相比，80、40、20 μg/ml OA組凋亡率(8.88%、12.94%和15.15%)均明顯下降(P<0.05)。

2.5NF-κB p65 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組NF-κB p65表達(dá)上調(diào)(3.53±0.51 vs 1.00±0.00，P<0.01)；與模型組相比，80、40、20 μg/ml OA保護(hù)組NF-κB p65表達(dá)降低(0.99±0.07、1.73±0.02、0.60±0.19，P<0.01)。

表1 OA對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12損傷的影響±s,n=4)

表2 OA對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞SOD、MDA活性的影響±s,n=5)

3 討 論

Aβ分子中決定其毒性的主要片段在25～35，常用于誘導(dǎo)AD的體外細(xì)胞模型〔6，7〕。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，1976年由Greene等建立，具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性，已廣泛用作神經(jīng)細(xì)胞體外模型〔8，9〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞存活率下降至58%，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明此模型可以作為評(píng)價(jià)OA神經(jīng)保護(hù)效果的神經(jīng)損傷體外模型。

CCK-8試劑盒是檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，具有靈敏度高、數(shù)據(jù)可靠、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。LDH是細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶，當(dāng)細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，胞質(zhì)中LDH大量釋放到細(xì)胞外，其漏出量與細(xì)胞受損程度相平行。因此，它們是檢測細(xì)胞功能狀態(tài)、受損程度和存活數(shù)量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，Aβ可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基使腦細(xì)胞膜系統(tǒng)的脂質(zhì)和蛋白被氧化修飾，使活性氧增加，促進(jìn)氧化反應(yīng)和過氧化物形成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，降低抗氧化作用，自由基損傷是Aβ發(fā)揮細(xì)胞毒性的方式之一。氧自由基也可促進(jìn)生成Aβ，二者具有相互促進(jìn)效應(yīng)。神經(jīng)細(xì)胞丟失是AD的一個(gè)重要特征，細(xì)胞凋亡是丟失的重要前提，Aβ能引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。SOD和MDA是反映自由基損傷最具有代表性指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞損傷與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，OA可能通過抗氧化、抗凋亡起到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

核因子-κB(NF-κB)是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，NF-κB/IκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是炎癥及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。Aβ可以直接或間接產(chǎn)生氧自由基(ROS)，ROS可激活神經(jīng)元內(nèi)的 NF-κB，進(jìn)而通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞的凋亡等多途徑參與 AD 的發(fā)病過程〔10〕。本研究提示Aβ25～35通過激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)NF-κBp65 mRNA過度表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡；OA可降低Aβ誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

本研究表明OA對(duì)AD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用，通過其抗氧化活性增強(qiáng)清除氧自由基能力，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)NF-κBp65 mRNA的表達(dá)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。OA作為一種天然化合物，不僅毒副作用低，而且可通過抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡多方面保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有開發(fā)為抗癡呆、抗衰老藥物前景，本實(shí)驗(yàn)為維藥瑣瑣葡萄防治AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供科學(xué)依據(jù)，為促進(jìn)維藥的理論發(fā)展，同時(shí)也為充分利用新疆豐富的葡萄資源，研發(fā)安全、有效、價(jià)廉AD民族新藥提供新思路。

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