曲美他嗪對(duì)心衰大鼠心臟功能和脂肪酸代謝的影響

陶志強(qiáng) 高 想 姜衛(wèi)東 唐艷芬 蔣鳳榮 張鋒莉

(南通市中醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

游離脂肪酸(FFA)代謝增加具有“心肌毒性”作用，在心力衰竭交感系統(tǒng)活性增強(qiáng)時(shí)更為嚴(yán)重。研究表明，使用胰島素和(或)葡萄糖降低血FFA水平，抑制FFA進(jìn)入線粒體，或者使用FFA氧化抑制劑曲美他嗪可改善心肌缺血狀態(tài)〔1〕。臨床上使用曲美他嗪治療缺血性心肌病取得了良好的效果，本研究探討降低FFA代謝對(duì)衰竭心肌的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 曲美他嗪(批號(hào)：660104)，北京賽科藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，抗體由美國B&R公司提供，引物由南京生物工程有限公司提供，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2動(dòng)物造模與分組 SD大鼠，雄性，體重(220±10) g，共24只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供〔許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005〕。參照文獻(xiàn)〔2〕采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心衰模型。主要步驟如下：SD大鼠以2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg腹腔麻醉，剪毛，開腹并分離暴露腹主動(dòng)脈，在雙側(cè)腎動(dòng)脈間分離該處腹主動(dòng)脈，將直徑約為0.6 mm的針灸針與腹主動(dòng)脈平行，1號(hào)線結(jié)扎固定，拔出針灸針，造成腹主動(dòng)脈縮窄，依次縫合肌層和皮膚，術(shù)后每日腹腔注射0.1 ml慶大霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組除開腹暴露、分離雙側(cè)腎動(dòng)脈間腹主動(dòng)脈但不行縮窄處理外，其余步驟與模型動(dòng)物處理一致。實(shí)驗(yàn)分組：除正常對(duì)照(假手術(shù))組外，隨機(jī)分為模型組、曲美他嗪低和高劑量組，每組6只。所有動(dòng)物均常規(guī)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行〔許可證號(hào)：SYXK(蘇)2005-0009〕。

1.3給藥方法 正常對(duì)照組：手術(shù)分離腹主動(dòng)脈，不進(jìn)行縮窄處理，手術(shù)4 w后雙蒸水灌胃，1次/d。模型組：造模4 w后，雙蒸水灌胃，1次/d。曲美他嗪低劑量組：造模4 w后，曲美他嗪5 mg/kg，1次/d，用雙蒸水稀釋后灌胃。曲美他嗪高劑量組：造模4 w后，曲美他嗪10 mg/kg，1次/d，用雙蒸水稀釋后灌胃。所有動(dòng)物均連續(xù)灌胃4 w。

1.4觀察項(xiàng)目

1.4.1心臟超聲檢查 大鼠以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后備皮,應(yīng)用捷達(dá)超聲工作站測定左室收縮期內(nèi)徑(LVS)、舒張期內(nèi)徑(LVD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS)。

1.4.2Real-Time PCR定量分析神經(jīng)激素相關(guān)基因腦鈉肽(BNP)、心鈉肽(ANP)、尿鈉肽受體(NPRC)mRNA表達(dá) 用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。Real-Time PCR反應(yīng)體系包括1 μl的cDNA模板(1%的RT產(chǎn)物)、7.5 μl SYBR Green Mix(Takara)及10 μmol/L終濃度的上、下游引物，加入H2O補(bǔ)足15 μl，擴(kuò)增條件為95℃ 5 s總變性以及95℃ 5 s、 60℃ 31 s循環(huán)40次。目的基因的mRNA水平用β-actin內(nèi)參校正，并將對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)水平設(shè)定為1。所有樣品每個(gè)基因的PCR反應(yīng)均為3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。引物序列分別為：BNP上游5′-TGGGCAGAAGATAGACCGGA-3′；下游5′-ACAACCTCAGCCCGTCACAG-3′；ANP上游5′-AACCTGCTAGACCACCTG-3′；下游5′-TTTTCAAGAGGGCAGATC-3′；NPRC上游5′-CGAGTATGGAAGCGAAGGTT-3′；下游5′-GGGAAATTGAGTTTGGGTTG-3′；β-actin上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3；下游5-TTCATCTTCATGGTGCTAGGA-3′。

1.4.3電鏡 放血處死大鼠，取大鼠左心室心肌，2.5%戊二醛固定后送南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院檢測，電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化。

1.4.4放射免疫法血清生化學(xué)檢測FFA、乳酸(LD) 按南京建成生物工程公司說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1超聲心動(dòng)圖 模型組LVS、LVD明顯增大，LVEF、FS明顯下降(P<0.01)；曲美他嗪治療后恢復(fù)，以高劑量組較明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組LVS、LVD、LVEF、FS、FFA、LD的變化±s，n=6)

2.2各組大鼠血清FFA和LD變化 模型組血清FFA、LD水平升高；曲美他嗪治療后與模型組比較，F(xiàn)FA、LD水平降低(P<0.05)。見表1。

2.3神經(jīng)激素相關(guān)基因mRNA表達(dá) 與正常組比較，模型組BNP、ANP、NPRC mRNA表達(dá)增高(3.72±0.43,4.92±0.68,1.86±0.24,P<0.01)，曲美他嗪治療后表達(dá)下調(diào)，而高劑量組BNP、ANP、NPRC mRNA下調(diào)(1.02±0.16，2.24±0.38，1.26±0.17)，較低劑量組BNP、ANP、NPRC mRNA(2.90±0.21，4.83±0.70，1.68±0.22)下調(diào)更明顯，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4電鏡 模型組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂，部分溶解，肌膜水腫，局部線粒體增多、腫脹，嵴消失，可見空泡結(jié)構(gòu)；曲美他嗪治療后未見明顯肌絲溶解，肌膜水腫；線粒體增多，基質(zhì)正常。見圖1。

圖1 各組線粒體結(jié)構(gòu)變化(×12 000)

3 討 論

一般情況下，心肌活動(dòng)所需能量的60%～90%來自FFA，剩余的10%～40%的能量由碳水化合物(葡萄糖、乳酸、酮體)代謝提供。研究表明，心肌細(xì)胞在正常供氧情況下，F(xiàn)FA供能時(shí)磷氧比值(P/O)為2.85，而利用葡萄糖供能則為3.15?？梢?，在消耗等量氧氣的情況下，脂肪酸代謝途徑比葡萄糖途徑產(chǎn)生的ATP少。心力衰竭時(shí)，心肌缺血缺氧能量生成不足，抑制FFA代謝，增加葡萄糖氧化供能對(duì)心肌更有益處。因此，抑制交感神經(jīng)過度激活，逆轉(zhuǎn)心肌代謝底物轉(zhuǎn)換，改善代謝重構(gòu)，是CHF代謝治療的理論基礎(chǔ)〔3〕。

曲美他嗪通過抑制長鏈3酮?；o酶A硫解酶(3-KAT)，直接抑制了脂肪酸氧化，同時(shí)間接通過增加活化的PDH刺激葡萄糖氧化增加。曲美他嗪可增加高濃度脂肪酸灌注的離體心臟的葡萄糖代謝水平，在心肌缺血時(shí)葡萄糖裂解ATP的再合成中需要的氧減少,優(yōu)化心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生,并可維持暴露于缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的生長及ATP的含量,保持其電活動(dòng)的穩(wěn)定性,減少缺血性攣縮,促進(jìn)心肌細(xì)胞功能恢復(fù)，為傳統(tǒng)心衰治療提供了獨(dú)特的補(bǔ)充和擴(kuò)展〔4〕。

本研究表明心衰時(shí)存在心肌細(xì)胞能量代謝的異常。曲美他嗪能降低FFA水平，具有改善心肌能量代謝作用，從而改善心衰大鼠模型的心室重構(gòu)，降低神經(jīng)激素相關(guān)基因表達(dá)，與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道相似〔5〕。

結(jié)合已有研究，分析曲美他嗪對(duì)衰竭心肌的保護(hù)作用機(jī)制為：①促進(jìn)葡萄糖氧化，利用有限的氧，更有效的產(chǎn)生ATP；②抑制FFA氧化，減少FFA堆積及氧化不全引起的線粒體線粒體應(yīng)激，線粒體功能得到恢復(fù)。Essop等〔6〕認(rèn)為，心力衰竭時(shí)，細(xì)胞內(nèi)FFA濃度升高,導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)氧化磷酸化與電子傳遞過程解耦聯(lián)，從而使心肌細(xì)胞有氧代謝效率降低、無效氧耗增加，加重心肌能量代謝障礙；而曲美他嗪可阻斷FFA的這種解耦聯(lián)作用，從而提高心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞的能量代謝效率，這與我們觀點(diǎn)一致，但其中機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1田 穎.心力衰竭代謝重構(gòu)及相關(guān)機(jī)制研究〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

2Anversea P，Hagopian M，Load AV,etal.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy〔J〕. Lab Invest,1973；29(3)：282.

3祝善俊.代謝重構(gòu)與慢性心力衰竭〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2007；9(6)：361-3.

4郭施勉,蘇文剛,卞申國,等.曲美他嗪對(duì)非缺血性擴(kuò)張型心肌病患者心功能和運(yùn)動(dòng)耐力的影響〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011；30(6):760-1.

5馬丕勇,李佳彧,楊 萍,等.曲美他嗪對(duì)缺血性心力衰竭大鼠心臟功能與氧自由基代謝的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011；15(4):614-6.

6Essop MF,Opie LH.Metabolic therapy for heart failure〔J〕.Eur Heart J，2004;25(20):1765-8.