高糖對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的影響

孫雅彬 王大廣 宋 鄂 葉 飛 張 泳 孫雅敏 徐越超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是正處在工作年齡的成年人失明的一個(gè)重要原因〔1,2〕。在視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞與葡萄糖的代謝關(guān)系極其密切，它可以優(yōu)先攝取葡萄糖，通過(guò)糖原代謝、有氧及無(wú)氧糖酵解為內(nèi)層其他細(xì)胞供能，并且Müller細(xì)胞的突起包繞在視網(wǎng)膜的神經(jīng)元及血管周圍，與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及視網(wǎng)膜血管發(fā)生多種功能的交互作用。在高糖等病理?xiàng)l件下，Müller細(xì)胞可以通過(guò)生理的和生物合成的變化，影響視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞的代謝活動(dòng)，干擾視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和血管的正常功能〔3～6〕。本文通過(guò)檢測(cè)不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖情況，了解高糖對(duì)Müller細(xì)胞增殖的影響，并且通過(guò)PPA技術(shù)檢測(cè)高糖與正常血糖濃度下Müller細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，明確高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1化學(xué)藥品 無(wú)血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司, 美國(guó)Fair Lawn))至終濃度為5，10， 25，50 mmol/L。

1.2大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 按照我們以往實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定〔7〕。

1.3細(xì)胞增殖 MTT法用以檢測(cè)高糖引起的Müller 增殖。第三代Müller 細(xì)胞接種于96孔板，每空細(xì)胞數(shù)約為5×103，無(wú)血清DMEM內(nèi)孵育24 h。更換為高糖條件液再次孵育72 h。 然后每孔加入5 mg/ml 的MTT 10 μl再次孵育3 h。去掉上清液，每孔加入100 μl DMSO，用ELx800(Bio-Tek Instruments公司，美國(guó) Winooski)分光光度儀，波長(zhǎng)570 nm測(cè)量每孔的光度值。

1.4Protein pathway array Müller 細(xì)胞(1×106) 于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h。然后細(xì)胞更換培養(yǎng)液為50 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72 h。用1倍細(xì)胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美國(guó)Danvers),包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L Na3VO4和1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取細(xì)胞總蛋白。 每個(gè)培養(yǎng)皿中加入300 μl裂解液，用細(xì)胞刮板刮除培養(yǎng)皿表面的單層細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物超聲裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，離心30 min。BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce公司，美國(guó)Rockford)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。按前文所描述〔8〕，進(jìn)行PPA流程。

1.5信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，一種基于互聯(lián)網(wǎng)的信號(hào)通路分析軟件，進(jìn)行蛋白質(zhì)之間生物功能的關(guān)聯(lián)性分析。 將PPA中檢測(cè)到的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)輸入IPA軟件，進(jìn)行經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路的功能性分析。以IPA軟件內(nèi)已知文獻(xiàn)中各基因或蛋白質(zhì)的相互作用為基礎(chǔ)，將所輸入蛋白質(zhì)之間的直接或間接的作用進(jìn)行分析，并最終構(gòu)建出新的信號(hào)通路。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的基因功能性分析，還能夠分析出所輸入蛋白質(zhì)與哪些已知疾病的最具有關(guān)聯(lián)性，并且應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算P值。蛋白質(zhì)在分析結(jié)果中被表示為“節(jié)點(diǎn)”，每?jī)蓚€(gè)“節(jié)點(diǎn)”之間的關(guān)系由一條直線表示，每條直線至少有一篇參考文獻(xiàn)支持。

2 結(jié) 果

2.1高糖刺激Müller 細(xì)胞增殖 孵育72 h后，Müller細(xì)胞的增長(zhǎng)呈葡萄糖濃度依賴性(50 mmol/L葡萄糖濃度增殖最強(qiáng))。

2.2高糖條件下Müller細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白 根據(jù)配對(duì)t檢驗(yàn)(P<0.05)和倍數(shù)變化值(>1.5)結(jié)果，在這些表達(dá)的蛋白質(zhì)中，有47種蛋白質(zhì)在正常葡萄糖濃度和高糖兩組間表達(dá)量有顯著性差異。其中40種蛋白質(zhì)在高糖條件下高表達(dá)，包括VEGF (10.58 倍)，XIAP (3.33 倍)，Cyclin E (9.02 倍)，Nkx-3.1(8.76 倍)，PDEF (6.03 倍)，TNF-α(5.70 倍)，NFκB p65(4.24 倍)，IL-1β (5.49 倍)，Cdk4(5.48 倍)，p-PKC-α/βⅡ(5.46 倍)，NFκB p50(5.21 倍)，Bax (5.01 倍)，p38 (4.96 倍)，cdk2 p34(4.14 倍)，p-PKC-α(4.02 倍)，Cyclin B1(3.95 倍)，Cdk6(3.73 倍)，Cdk2(3.64 倍)，p-PTEN(3.56 倍)，Cyclin D1(3.38 倍)，Cdc25B(3.29 倍)，PTEN(2.98 倍)，Cdc25C(2.90 倍)，HIF-1α(2.59 倍)，ERK(2.55 倍)，p-Stat3(2.41 倍)，HIF-3α(2.40 倍)，p27(2.35 倍)，Bcl-6(2.30 倍)，Bcl-xL(1.89 倍)，uPA(1.54 倍)和p-AKT(1.53 倍)；其中7種蛋白質(zhì)在高糖條件下表達(dá)下調(diào)，包括 p-GSK-3a/β(-9.24 倍)，p-p53(-7.35)，Erα(-4.56 倍)，KAI1(-3.53 倍)和RIP(-2.36 倍)?；贗PA結(jié)果，這47種蛋白質(zhì)參與了幾條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括XIAP/Apoptosis信號(hào)通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信號(hào)通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信號(hào)通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信號(hào)通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，細(xì)胞周期：G1/S 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號(hào)通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信號(hào)通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，細(xì)胞周期：G2/M 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號(hào)通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信號(hào)通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信號(hào)通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信號(hào)通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信號(hào)通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信號(hào)通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰島素受體信號(hào)通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。這些結(jié)果提示高糖可以引起 Müller 細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路改變，這些改變共同促使Müller細(xì)胞存活和增殖。

2.3IPA軟件構(gòu)建出高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)關(guān)系圖 將PPA結(jié)果所篩選的47種差異表達(dá)蛋白質(zhì)輸入IPA信號(hào)通路軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建出這些蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系圖(圖1)。

圖1 高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討 論

在糖尿病患者眼內(nèi)Müller細(xì)胞表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞數(shù)量增多〔9〕。神經(jīng)膠質(zhì)增生出現(xiàn)在血腦屏障破壞之后，這樣就進(jìn)一步加重了血管功能障礙。神經(jīng)膠質(zhì)增生可能是由氧化應(yīng)激以及多元醇通道的激活引起，因?yàn)檫@些通道的藥理激活抑制了膠質(zhì)纖維酸性蛋白的上調(diào)。糖尿病患者以及動(dòng)物模型的Müller細(xì)胞的數(shù)量都增加了并且Müller細(xì)胞也被激活了，這體現(xiàn)在膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAF)以及巢蛋白的表達(dá)上調(diào)〔10〕。

Müller細(xì)胞會(huì)釋放血管生成因子以及神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子以保護(hù)視網(wǎng)膜免受高血糖癥誘導(dǎo)應(yīng)力并最終對(duì)DR的發(fā)病機(jī)制做出貢獻(xiàn)。VEGF是從DR早期的Müller細(xì)胞中釋放出來(lái)的〔11〕，并且通過(guò)局部增加血管的滲透性來(lái)提高灌注，同時(shí)抗血管生成的PEDF也減少了〔12〕。VEGF以及其他的分泌因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的，而且它們可能會(huì)保護(hù)神經(jīng)元免受高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激〔13〕。目前尚不清楚血管生成因子的作用是否支持糖尿病視網(wǎng)膜中的應(yīng)力神經(jīng)元或是增加閉塞血管的滲透性。慢性暴露于這些因子會(huì)導(dǎo)致一個(gè)兩相的視網(wǎng)膜反應(yīng)，而且增加的滲透性會(huì)促進(jìn)應(yīng)力因子的進(jìn)一步滲透并最終釋放更多的滲透因子從而形成一個(gè)有害的正回饋循環(huán)。這樣就行成了糖尿病黃斑水腫，而且它是患有DR患者失明的一個(gè)主要原因〔14〕。在糖尿病患者以及動(dòng)物模型的玻璃體以及視網(wǎng)膜中已經(jīng)檢測(cè)到VEGF〔15,16〕。此外，VEGF以及PEDF的眼內(nèi)層能夠?qū)Ψ窃鲋称贒R向增殖期DR的轉(zhuǎn)變做出預(yù)測(cè)〔14〕。同樣地，對(duì)VEGF的抑制會(huì)阻止患有糖尿病動(dòng)物的血視網(wǎng)膜屏障的衰退而且在臨床上已經(jīng)開(kāi)始血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體的作用來(lái)治療糖尿病黃斑水腫以及增殖期DR〔17,18〕。

膠質(zhì)激活可能會(huì)導(dǎo)致與DR進(jìn)程相關(guān)的炎癥。Müller細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者是滲透到視網(wǎng)膜的白細(xì)胞都可以分泌細(xì)胞因子〔19〕?；钚匝跻约巴砥谔腔K末產(chǎn)物的受體都已經(jīng)在Müller細(xì)胞上得到表達(dá)，而且它們對(duì)于DR的發(fā)病機(jī)制都是非常重要的，因?yàn)榘被抑委煏?huì)抑制DR在動(dòng)物模型的發(fā)展〔20〕。誘生型氮氧合酶的數(shù)量在糖尿病人類患者以及動(dòng)物模型都增加了而且它和VEGF超表達(dá)一樣都位于Müller細(xì)胞，而且它還可能與糖尿病中血視網(wǎng)膜屏障破壞有關(guān)〔21〕。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰的顯示，高糖可以刺激Müller細(xì)胞增殖，這種增殖作用是Müller細(xì)胞中幾條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路共同參與的結(jié)果，并且 PPA結(jié)果 和IPA 軟件分析證實(shí)高糖影響了細(xì)胞內(nèi)許多經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括 XIAP/凋亡信號(hào)通路，VEGF 信號(hào)通路和細(xì)胞循環(huán)調(diào)控通路等。這些信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化可以減少M(fèi)üller 凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，為DR的發(fā)病機(jī)制研究提供新的依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Fong DS, Aileeo LP, Ferris FL, 3RD,etal. Diabetic retinopathy 〔J〕. Diabetes care,2004;27(10): 2540-53.

2Kilein R,Klein BE.Diabetic eye disease 〔J〕. Lancet,1997;350(9072): 197-204.

3Fletcher EL,Phipps JA,Ward MM,etal. Neuronal and glial cell abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy 〔J〕. Current pharmaceutical design, 2007;13(26): 2699-712.

4Zeng XX, Ng YK,Ling EA. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats 〔J〕. Visual Neurosci, 2000;17(3):463-71.

5Mizutani M,Gerhardinger C,Lorenzi M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy 〔J〕. Diabetes,1998;47(3): 445-9.

6Bai Y,Ma JX,Guo J,etal. Muller cell-derived VEGF is a significant contributor to retinal neovascularization 〔J〕.J Pathol,2009;219(4):446-54.

7Sun Y,Wang D,Ye F. Elevated cell proliferation and VEGF production by high-glucose conditions in Müller cells involve XIAP〔J〕. Eye (Lond),2013;27(11):1299-307.

8Ye F,Che Y,Mcmillen E,etal.The effect of Scutellaria baicalensis on the signaling network in hepatocellular carcinoma cells 〔J〕. Nutr Cancer,2009;61(4): 530-7.

9Saydah SH,Fradkin J,Cowie CC. Poor control of risk factors for vascular disease among adults with previously diagnosed diabetes 〔J〕. JAMA,2004;291(3): 335-42.

10Ly A, Yee P,Vessey KA,etal. Early inner retinal astrocyte dysfunction during diabetes and development of hypoxia, retinal stress, and neuronal functional loss 〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci,2011;52(13): 9316-26.

11Wang J,Xu X,Elliiott MH,etal. Muller cell-derived VEGF is essential for diabetes-induced retinal inflammation and vascular leakage 〔J〕. Diabetes, 2010;59(9): 2297-305.

12Zhang SX,Wang JJ,Gao G,etal. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is an endogenous antiinflammatory factor 〔J〕. FASEB J,2006;20(2): 323-5.

13Mark RJ,Keller JN,Kruman I,etal. Basic FGF attenuates amyloid beta-peptide-induced oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and impairment of Na+/K+-ATPase activity in hippocampal neurons 〔J〕. Brain Res,1997;756(1-2): 205-14.

14Fong DS,Aiello LP,Ferris FL,3RD,etal. Diabetic retinopathy 〔J〕. Diabetes Care, 2004;27(10): 2540-53.

15Funatsu H,Yamashita H,Ikeda T,etal. Vitreous levels of interleukin-6 and vascular endothelial growth factor are related to diabetic macular edema 〔J〕. Ophthalmology,2003;110(9):1690-6.

16Ogata N,Nishikawa M,Nishimura T,etal. Unbalanced vitreous levels of pigment epithelium-derived factor and vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy 〔J〕. Am J Ophthalmol,2002;134(3): 348-53.

17Avery RL,Pieramici DJ,Rabena MD,etal. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for neovascular age-related macular degeneration 〔J〕. Ophthalmology,2006;113(3): 363-72 e5.

18Qaum T,Xu Q,Joussen AM,etal. VEGF-initiated blood-retinal barrier breakdown in early diabetes 〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci,2001;42(10): 2408-13.

19Goldstein IM,Ostwald P,Roth S. Nitric oxide: a review of its role in retinal function and disease 〔J〕. Vision Res,1996;36(18):2979-94.

20Tezel G,Luo C,Yang X. Accelerated aging in glaucoma: immunohistochemical assessment of advanced glycation end products in the human retina and optic nerve head 〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007;48(3):1201-11.

21Barile GR,Pachydaki SI,Tari SR,etal. The RAGE axis in early diabetic retinopathy 〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2005;46(8): 2916-24.