復方健耳劑對DBA/2J小鼠耳蝸組織超氧化物歧化酶1表達的影響

宣 毅 黃正團 周仲昭 宣偉軍

(School of Engineering，Tufts University，Medford，Massachusetts 02155，USA)

細胞凋亡被認為是衰老的重要因素之一〔1〕,也是耳蝸損害的重要機制之一〔2〕。銅(Cu)、鋅(Zn)、超氧化物歧化酶(SOD)是耳蝸最重要的自由基代謝酶，構(gòu)成耳蝸抗氧化關(guān)鍵防御系統(tǒng)〔3〕。復方健耳劑具有對抗小鼠老年性耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡及疆孔神經(jīng)纖維退變的作用〔4，5〕，本研究應用Real-Time PCR技術(shù)，以幼齡即開始出現(xiàn)聽力衰退的DBA/2J小鼠作為試驗對象〔6，7〕，觀察復方健耳劑對小鼠耳蝸組織SOD1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 美國GeneCopoeia 公司提供： mRNA合成單鏈擴增的反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit(Cat.No.C0210A )；PCR(染料法)試劑All-in-OneTMQ-PCR Mix(Cat.No.D0101A)；熒光定量PCR引物All-in-OneTMQ-PCR Primer(Cat.No.HQP006940) 。由美國Invitrogen公司提供總RNA抽提試劑TRIzol (Cat.No 15596-018)。美國Bio-Rad實時定量PCR檢測系統(tǒng)：MyiQ5 Real Time PCR Detection System。日本TaKaRa常規(guī)PCR儀：PCR Thermal Cycler。美國Thermo Fisher Scientific紫外分光光度計：NanoDrop ND-1000。

1.2動物及分組 選擇斷奶1月齡、SPF級、健康DBA/2 J小鼠共10只，實驗動物由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。動物的雌雄不拘，隨機平均分為對照組和中藥組各5只。對照組小鼠食用小鼠常規(guī)飼料和飲用自來水。中藥組小鼠食用相同的小鼠常規(guī)飼料，但飲用中藥水煮溶液以代替日常飲水，各組均待小鼠成長至5月齡時終止實驗，然后斷頭取兩側(cè)耳蝸置液氮中冰凍備用。

1.3實驗藥物及喂藥 本次實驗所用中藥復方健耳劑選自原健耳Ⅱ號中成藥膠囊配方，由黃芪、女貞子、丹參、郁金、絞股藍等藥組成，但改為原始湯劑口服液，即水煮3次，過濾，濃縮至1∶1.22，相當于1.22 ml含1 g生藥材量。按照《中藥藥理研究方法學》〔8〕小鼠與成人用量換算法計算出小鼠用量應為，復方健耳劑0.7 ml·kg-1·d-1，并加上適量水配兌(一般為1 ml藥液加20 ml水),盛在動物自吸喂養(yǎng)瓶內(nèi)供小鼠飲用。在無其他水源供應的條件下，動物基本因口渴可飲下每日內(nèi)服中藥劑量。

1.4檢測方法 選擇PCR內(nèi)參引物序列GAPDH：正義鏈(5′-3′)：CTTGGGCTACACTGAGGACC，反義鏈(5′-3′):CATACCAGGAAATGAGCTTGAC。PCR目標引物序列SOD1：正義鏈(5′-3′)GGGTTCCACGTCCATCAGTA，反義鏈(5′-3′)：AGTCACATTGCCCAGGTCTC。每組5對耳蝸標本在液氮中充分研磨成粉末狀，加入到TRizol液中，震蕩混勻，加入氯仿，振蕩混勻，離心，相分離，取最上層，獲得RNA樣品，置入冷凍異丙醇的新離心管(DEPC處理管)中混勻，離心，RNA沉淀，冷凍75%乙醇，離心，RNA洗滌，去上清液，風干揮發(fā)乙醇，加入DEPC水，在Nanodrop上測定RNA濃度和OD 260/280比值，確認RNA沒有蛋白等污染。RNA-Primer Mix 配制反應，離心，65℃RNA變性，在RNA-Primer Mix反應管內(nèi)加入反轉(zhuǎn)錄反應液，離心后37℃孵育，85℃滅活處理，滅菌水稀釋，-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物待用。制備PCR反應混合液，加入96孔板中，離心，確保所有反應液在反應孔底部。在MyiQ5 Real Time PCR Detection System中經(jīng)溫度梯度分別進行預變性、變性、退火、延伸等反應處理，測出內(nèi)參基因GAPDH和目的基因SOD1在不同樣本中擴增的Ct值。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

對照組耳蝸組織SOD1表達量為1.624±0.425較中藥組(5.114±2.432)明顯降低(t=-3.817，P<0.019)。

3 討 論

氧自由基升高或耗竭內(nèi)源性抗氧化劑可導致神經(jīng)細胞凋亡〔9～11〕。氧自由基誘導細胞凋亡的確切機制目前尚未完全闡明，一般認為，活性氧自由基(ROS) 可以通過脂質(zhì)過氧化損傷DNA，影響信號傳導以及參與調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因而誘導細胞凋亡。原癌基因Bcl-2是線粒體死亡途經(jīng)中調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因， Bcl-2抗凋亡的機制是通過抗氧化途徑。在各種癌組織中，Bcl-2表現(xiàn)為過度表達，其抗細胞凋亡的功能大小與其表達水平密切相關(guān)。ROS是重要的細胞內(nèi)分子傳導信號，能夠調(diào)控Bcl-2表達，從而影響B(tài)cl-2的功能。研究已證實超氧化物陰離子(O2-)能夠下調(diào)或降低Bcl-2表達，進而誘使蛋白酶體介導泛素依賴性的蛋白酶解反應，降解細胞質(zhì)中的目標蛋白以及核內(nèi)蛋白，導致細胞凋亡〔12〕。也有研究認為〔13〕，氧自由基能夠引起DNA損傷，導致DNA 模板的構(gòu)象變化，即 mtRNA 氧化損傷后可造成堿基片段丟失，堿基修飾及插入突變，導致多聚ADP 核糖聚合酶(PARP)活化，使糖氧化分解、電子傳遞和ATP 形成減慢，導致細胞內(nèi)ATP池枯竭，DNA修復無效并發(fā)生片段化，成為細胞凋亡的觸發(fā)因子，引起細胞凋亡。

研究表明老年性聾與耳蝸感音神經(jīng)細胞線粒體ROS積累并攻擊損害細胞密切相關(guān)〔20〕?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明中藥復方健耳劑所選藥物具有廣泛藥理作用，符合針對老年性聾的現(xiàn)代多種病因?qū)W說。其中改善血循環(huán)，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，清除自由基可能是其有效保護耳蝸老年性退變的主要藥理效應。自由基影響學說是機體衰老的重要機制之一。一方面氧自由基產(chǎn)生和積累過多，作用于生物膜上的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，從而破壞生物膜的完整性，引起毛細胞等代謝障礙〔21〕，或細胞內(nèi)線粒體DNA損傷，導致基因突變，引起老年性聾〔22〕。復方健耳劑中已知所選藥物如黃芪、女貞子、丹參、郁金、絞股藍等能明顯提高機體超氧化物歧化酶和谷胱苷肽酶含量和活性，和細胞膜Na+,K+-ATP酶活性，促進抗氧化，增強機體清除自由基能力，阻止細胞膜和線粒體膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而起到保護細胞膜和線粒體膜的作用〔23，24〕。本研究結(jié)果提示復方健耳劑能夠促進抗氧化，增強細胞清除自由基能力，從而有效保護細胞膜和線粒體膜，起到對抗和延緩老年性聾的作用。因此，復方健耳劑對SOD1的表達影響可能是其有效對抗老年性耳蝸感音神經(jīng)性損害的重要機制之一。

4 參考文獻

1Seidman MD.Effects of dietary restriction and antioxidants on presbyacusis〔J〕.Laryngoscope，2000；110(5 Pt 1):727-38.

2Ikeda K，Sunose H，Takasaka T.Effects of free radicals on the intracellular calcium concentration in the isolated outer hair cell of the guinea pig cochlea〔J〕.Acta Otolaryngol，1993；113(2):137-41.

3Pierson MG，Gray BH.Superoxide dismutase activity in the cochlea〔J〕.Hear Res，1982；6(2):141-51.

4宣偉軍，黃正團，丁大連.中藥健耳Ⅱ號膠囊對抗C57BL/6J小鼠老年性耳蝸損害的實驗研究〔J〕.聽力學及言語疾病雜志，2007；15(1):47-50.

5宣偉軍，丁大連.中藥聰耳膠囊干預老年性耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)和疆孔神經(jīng)損害的實驗研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2007；22(6):355-9.

6Zheng QY，Johnson KR.Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice〔J〕.Hear Res，2001；154(12):45-53.

7Johnson KR，Zheng QY，Erway LC.A major gene affecting age-related hearing loss is common to at least ten inbred strains of mice〔J〕. Genomics，2000；70(2):171-80.

8陳 奇.中藥藥理研究方法學〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993:1103-5.

9Franklin JL.Redox regulation of the intrinsic pathway in neuronal apoptosis〔J〕.Antioxid Redox Signal，2011；14(8):1437-48.

10Patten DA，Germain M，Kelly MA,etal.Reactive oxygen species：stuck in the middle of neurodegeneration〔J〕.J Alzheimers Dis，2010；20(Suppl 2):S357-67.

11Niizuma K，Yoshioka H，Chen H,etal.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010；1802(1):92-9.

12Azad N，Iyer A，Vallyathan V,etal.Role of oxidative/nitrosative stress-mediated Bcl-2 regulation in apoptosis and malignant transformation〔J〕. Ann N Y Acad Sci，2010；1203:1-6.

13Matés JM，Sánchez-Jiménez FM.Role of reactive oxygen species in apoptosis：implications for cancer therapy〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2000;32(2):157-70.

14Balaban RS，Nemoto S，F(xiàn)inkel T.Mitochondria，oxidants，and aging〔J〕. Cell， 2005；120(4):483-95.

15Sun J，F(xiàn)olk D，Bradley TJ,etal.Induced overexpression of mitochondrial Mn-superoxide dismutase extends the life span of adult Drosophila melanogaster〔J〕.Genetics，2002；161(2):661-72.

16Runko AP，Griswold AJ，Min KT.Overexpression of frataxin in the mitochondria increases resistance to oxidative stress and extends lifespan in Drosophila〔J〕.FEBS Lett，2008；582(5):715-9.

17Schriner SE，Linford NJ，Martin GM,etal.Extension of murine life span by overexpression of catalase targeted to mitochondria〔J〕.Science，2005；308(5730):1909-11.

18Tabuchi K，Hoshino T，Hirose Y,etal.Age-related hearing loss and expression of antioxidant enzymes in BDF1 mice〔J〕.Acta Otolaryngol，2011；131(10):1020-4.

19McFadden SL，Ding D，Salvi R.Anatomical，metabolic and genetic aspects of age-related hearing loss in mice〔J〕.Audiology，2001；40(6):313-21.

20Someya S，Prolla TA.Mitochondrial oxidative damage and apoptosis in age-related hearing loss〔J〕.Mech Ageing Dev，2010；131(7-8):480-6.

21Dehne N，Lautermann J，Ten Cate WJ，etal.In vitro effects of hydrogen peroxide on the cochlear neurosensory epithelium of the guinea pig〔J〕. Hear Res，2000；143(1-2)：162-70.

22Bai U，Seidman MD，Hinojosa R，etal.Mitochondrial DNA deletions associated with aging and possibly presbycusis：a human archival temporal bone study〔J〕.Am J Otol，1997；18(4)：449-53.

23王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應用〔M〕.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：125-7,190-200,669-71，983-98.

24王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學〔M〕.天津：天津科學技術(shù)出版社，1999：1228-30.