人IFN-γ基因啟動子的克隆鑒定及功能分析

湯必奎 程 禹 翟素蓮 劉小粉 胡明潔 吳守偉

(蚌埠醫(yī)學院生物科學系，安徽 蚌埠 233030)

IFN-γ是由機體內(nèi)活化的T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，具有抗感染、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細胞、提高MHCⅠ類和Ⅱ類分子的表達、促進抗原提呈等，在機體抗感染與免疫中發(fā)揮重要作用〔1～3〕?，F(xiàn)有研究認為其主要通過JAK-STAT、PI3K等途徑激活〔4，5〕，但近期有報道提示IFN-γ激活和其調(diào)控區(qū)域的DNA甲基化修飾相關(guān)，如在Th1/Th2細胞分化過程中的IFN-γ表達和調(diào)控區(qū)域甲基化狀態(tài)相關(guān)〔6〕。DNA甲基化調(diào)控主要和基因啟動子區(qū)域相關(guān)，高甲基化狀態(tài)時基因沉默，而低甲基化狀態(tài)時基因激活，所以為研究IFN-γ表達的表觀遺傳學修飾機制，本研究中首先克隆了啟動子區(qū)域并進行功能分析和甲基化狀態(tài)的鑒定，為后繼研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和細胞E.coliDH5菌株為本實驗室保藏；pGL3-basic和pRL質(zhì)粒購自Promega公司；人胚腎來源細胞系HEK293T培養(yǎng)基為DMEM含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/L鏈霉素，培養(yǎng)于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱。

1.2試劑 分子克隆所有試劑購自Takara公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen公司；無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒小抽試劑盒購自Qiagen公司；細胞培養(yǎng)試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000購自Invitrogen公司；熒光素酶檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司；ploy I:C dsRNA購自Sigma公司；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Sss Ⅰ購自NEB公司；DNA合成和測序由Invitrogen公司完成；其他分析純試劑購自上海國藥有限公司。

1.3方法

1.3.1生物信息學分析 人IFN-γ基因序列(No：NC_000012.11)從美國國立生物技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)獲得；啟動子預測及轉(zhuǎn)錄因子分析利用在線數(shù)據(jù)庫Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)完成；甲基化分析利用MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)完成。

1.3.2引物設(shè)計和PCR擴增 根據(jù)生物信息學預測結(jié)果設(shè)計一對特異性引物(Invitrogen公司合成)，IFNγ-F：5′-CGACGCGTTTTCTACTGGGCAGTGCTGA-3′，IFNγ-R：5′-CCGCTCGAGCGTTTCCGAGAGAATTAAGC-3′。以人類來源的基因組為模板進行PCR擴增，反應條件為95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.3.3熒光素酶載體的構(gòu)建 擴增得到的700 bp產(chǎn)物凝膠電泳純化回收后，用限制性內(nèi)切酶MIuⅠ和XhoⅠ雙酶切，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。pGL3-Basic 質(zhì)粒用MIuⅠ和XhoⅠ雙酶切后使用膠回收試劑盒回收純化。分別酶切純化的擴增片段和質(zhì)粒片段用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α細胞，先菌液PCR初步篩選陽性克隆，再通過雙酶切和測序驗證，即得到含有IFN-γ潛在啟動子區(qū)域的luciferase報告載體，命名為pIFNγ。

1.3.4細胞轉(zhuǎn)染和啟動子活性的檢測 HEK293T細胞按2×105鋪板于48孔細胞培養(yǎng)板中，待生長至密度為70%～80%時，用pIFNγ報告質(zhì)粒和內(nèi)參照海腎熒光素酶(Renilla)報告載體pRL共轉(zhuǎn)染，24 h后換為不完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h按照Dual-Luciferase Reporter Assay System用化學發(fā)光儀檢測熒光素酶的活性。每個樣本進行3～4個平行孔實驗，啟動子活性以螢火蟲熒光素酶(Luciferase)催化反應底物產(chǎn)生的熒光信號強度讀值與內(nèi)參照海腎熒光素酶(Renilla)催化產(chǎn)生的熒光信號強度讀值的比值來表示，即相對熒光強度(RLA)。

1.3.5體外甲基化分析 1 μg的pIFNγ報告質(zhì)粒用Sss Ⅰ于37 ℃處理30 min后，PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，再用此質(zhì)粒和pRL共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，檢測啟動子活性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.5 軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得IFN-γ基因序列(NC_000012.11)，截取從翻譯起始點ATG后30 bp開始至上游5 000 bp的區(qū)域(即68556371-68553371)進行分析。首先用Promoter 2.0進行分析，提示前700 bp區(qū)域得分最高，再用TFSEARCH Search分析該區(qū)域存在大量轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點，所以我們初步將該區(qū)域確定在翻譯起始點ATG前-1～-688區(qū)域，具體序列見圖1A。同時，對該區(qū)域做了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，顯示存在大量結(jié)合位點，以及該區(qū)域存在大量的可能甲基化CG位點，如圖1B所示。

2.2pIFNγ載體構(gòu)建 以正常成人外周血來源基因組為模板，IFNγ-F和IFNγ-R引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見成功擴增出IFN-γ基因啟動子片段，與預計片段大小一致為700 bp左右(圖2A)。將目的片段和pGL3載體連接轉(zhuǎn)化后菌落PCR鑒定，可見有陽性克隆(圖2B)，克隆提取質(zhì)粒后MluⅠ和XhoⅠ雙酶切可見700 bp插入目的片段(圖2C)。將這兩個克隆進行測序，結(jié)果和NCBI參考序列一致，說明含IFN-γ啟動子區(qū)域的luciferase報告載體構(gòu)建成功。

A：選定的啟動子區(qū)域，下劃線C為轉(zhuǎn)錄起始點，下劃線ATG為翻譯起始點；B：該區(qū)域的甲基化位點分析

2.3pIFNγ載體活性分析 為驗證構(gòu)建的pIFNγ載體是否有活性，將pIFNγ或pGL3空載體和內(nèi)參照載體pRL共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后檢測相對熒光強度。pIFNγ可以顯著啟動luciferase活性(22.4±3.1)，而pGL3載體(1.1±0.2)和不轉(zhuǎn)染的空細胞(0.2±0.1)不能啟動luciferase活性，說明插入的IFN-γ啟動子片段具有活性。同時，已知IFN-γ可被dsRNA誘導表達，進一步檢測pIFNγ是否能被dsRNA polyIC激活，polyIC可顯著增強IFN-γ啟動子活性(81.7±2.4)，是加PBS的mock對照(25.5±3.9)的3倍左右，進一步說明pIFNγ構(gòu)建的成功。

2.4DNA甲基化影響pIFNγ活性 從前面的生物信息學預測發(fā)現(xiàn)克隆的IFNγ啟動子區(qū)域有潛在的甲基化位點，而甲基化是和基因表的的沉默相關(guān)。據(jù)此，本研究分析了pIFNγ載體甲基化后對IFNγ啟動子活性的影響，當使用體外甲基化酶SSSI處理后，啟動子活性下降達5倍(42.2±3.4 vs 8.9±1.3)，這和理論推斷一致，也進一步驗證了pIFNγ載體的功能。

A：PCR擴增目的片段，泳道1為擴增產(chǎn)物；B：菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化克隆，泳道1～8為待鑒定菌落；C：雙酶切鑒定菌落PCR陽性克隆，泳道1,2分別代表B中的5和7菌株；M：DL2000 DNA Marker

3 討 論

病毒感染被宿主免疫識別后啟動天然免疫應答和適應性免疫應答，其中IFN-γ是一個非常重要的抗病毒因子，其機制是通過JAK-STAT等途徑激活，但新近的研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ的表達和表觀遺傳學機制相關(guān)。表觀遺傳學是一類不涉及遺傳物質(zhì)改變的基因調(diào)節(jié)方式，發(fā)現(xiàn)其幾乎存在于生物調(diào)控的所有環(huán)節(jié)，在發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中都扮演著重要的作用，其中一個重要機制是DNA甲基化，高甲基化狀態(tài)和基因沉默相關(guān)，而低甲基化則和基因激活相關(guān)〔7，8〕。本研究結(jié)果提示其具有啟動活性，在激活劑dsRNA刺激下，活性顯著上調(diào)，說明克隆的區(qū)域具有啟動子活性。同時為了驗證啟動子活性是否和DNA甲基化相關(guān)，用SssⅠ體外甲基化后發(fā)現(xiàn)其活性顯著下降，進一步驗證克隆的區(qū)域具有活性。

4 參考文獻

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