天王補(bǔ)心湯、六味地黃湯治療血管性癡呆小鼠的療效對(duì)比

劉豐熙 牛 凱 李 煒 薛貴平 王 樹 張丹參

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

血管性癡呆(VD)占全部老年癡呆的35.8%～39%，是僅次于阿爾茨海默病(AD)的第二大癡呆病因。VD屬于中醫(yī)的 “癡呆”、“呆癥”、“健忘”等的范疇〔1〕，病位在腦，與心和腎的關(guān)系密切。目前對(duì)于中藥復(fù)方治療VD的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道不多，對(duì)比其治療效果的研究更少。李東騰等〔2〕曾做過天王補(bǔ)心丹改善記憶的研究，馮炯等〔3〕曾做過六味地黃丸改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶的研究。本實(shí)驗(yàn)從補(bǔ)心、補(bǔ)腎治療角度入手，選擇補(bǔ)益心血的代表方天王補(bǔ)心湯、補(bǔ)益腎精的代表方六味地黃湯作為研究對(duì)象，通過對(duì)VD治療效果的互相比較研究，找出治療VD的較佳方藥。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康昆明種小鼠，體重(28±2)g，均為雄性，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。全部動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)，分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。室溫(20±2)℃。

1.2主要藥品、試劑 天王補(bǔ)心湯：酸棗仁、柏子仁、當(dāng)歸、天冬、麥冬、生地、人參、丹參、玄參、白茯苓、遠(yuǎn)志、桔梗；六味地黃湯：熟地、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓；均購自張家口市華佗藥房，藥液先按照臨床用藥煎煮方法熬制成常規(guī)藥液。腦復(fù)康：購自石家莊市華新制藥廠，批號(hào)N091203。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所。3.5%水合氯醛、液體石蠟、生理鹽水(NS)、肝素、0.025 mmol/L氯化鈣、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液。

1.3儀器 SBA-2程控避暗箱：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。XTY-2探索運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)儀：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。STT-2跳臺(tái)儀：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。LabTech紫外可見分光光度計(jì)UA-2100：北京萊博泰科儀器有限公司。Sigma-3k30：高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司。BT224S電子天平：德國Sartorius公司。1512型石蠟切片機(jī)：西德萊卡公司。TS-12E自動(dòng)脫水機(jī)：湖北孝感電子儀器廠。LKB NovaIV超薄切片機(jī)：瑞典LKB公司。顯微鏡：YM200，日本OLYMPUS。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、腦復(fù)康組、六味地黃湯組、天王補(bǔ)心湯組，每組15只。

1.4.2模型制備與給藥方法 在Himori法〔4〕基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。3.5%水合氯醛(10 ml/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，仰臥位固定，自胸骨柄到下頜骨間行5～8 mm正中縱向切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，分離后用液體石蠟浸泡過的黑色手術(shù)線穿過左右二側(cè)頸總動(dòng)脈，盡量恢復(fù)兩側(cè)頸總動(dòng)脈到原位，在氣管上方輕輕將黑色手術(shù)線打一松的反手結(jié)，結(jié)的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側(cè)頸總動(dòng)脈上方的黑線上穿過一條用液體石蠟浸泡過的白色手術(shù)線，按Himori法埋線后縫合切口。術(shù)后48 h將頸下部黑色手術(shù)線拉緊，阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)， 5 min后輕拉兩側(cè)白色手術(shù)線，使頸總動(dòng)脈恢復(fù)血液再灌注。術(shù)后各組動(dòng)物均灌胃給藥，給藥標(biāo)準(zhǔn)為20 ml/kg，六味地黃湯組、天王補(bǔ)心湯組、腦復(fù)康組小鼠每日早7:00給藥，1次/d；正常組、假手術(shù)組、模型組每日早7:00給予等量蒸餾水，1次/d；共給藥14 d。

1.5行為學(xué)實(shí)驗(yàn)〔5〕

1.5.1避暗實(shí)驗(yàn) 給藥后1 h進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和測(cè)試，訓(xùn)練前將小鼠放入避暗箱內(nèi)適應(yīng)3 min，然后將小鼠背向洞口放入明室，同時(shí)啟動(dòng)自動(dòng)記錄裝置，由于小鼠具有嗜暗習(xí)性，易進(jìn)入暗室，進(jìn)入暗室后由于受到電擊迅速逃離暗室。在5 min內(nèi)經(jīng)多次電擊，小鼠形成記憶，記錄24 h后測(cè)驗(yàn)時(shí)3 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))以及首次犯錯(cuò)誤的時(shí)間(逃避潛伏期)。

1.5.2跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 給藥后1 h進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng) 3 min，然后立即通以36 V的交流電，動(dòng)物受到電擊，其逃避反應(yīng)即為跳上平臺(tái)，部分動(dòng)物會(huì)再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)，如此訓(xùn)練 3 min。24 h后，在底部銅柵通電的情況下，直接將小鼠輕輕置于平臺(tái)上，記錄從小鼠被放至平臺(tái)到第一次跳下的時(shí)間，即潛伏期；同時(shí)記錄 3 min內(nèi)小鼠跳下平臺(tái)的次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5.3探索實(shí)驗(yàn) 給藥后1 h進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，首先將小鼠放在前面的明室中，點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)開始，同時(shí)打開箱門，當(dāng)小鼠鉆進(jìn)暗室時(shí)，則關(guān)上門斷其后路。記錄小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間;小鼠在暗室滯留時(shí)間、小鼠在明室滯留時(shí)間、小鼠爬高端的次數(shù)。

1.6小鼠腦組織生化指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1腦組織勻漿的制備 按照文獻(xiàn)方法〔6，7〕，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠迅速斷頭處死，在生理鹽水冰塊上迅速打開顱骨取腦，將腦膜和小腦剝離，保留大腦，用冷生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干表面的水分，稱重，放入干燥的玻璃器皿中，加入9倍重量的4℃生理鹽水，用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)勻漿，轉(zhuǎn)速10 000～15 000 r/min，每次勻漿10 s，間隔30 s，連續(xù)3～5次，即可制成10%腦勻漿，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.6.2小鼠腦組織內(nèi)SOD，丙二醛(MDA)含量測(cè)定 取按照1.6.1方法制備好的腦勻漿上清液適量，按照SOD，MDA試劑盒說明書測(cè)定，計(jì)算小鼠腦組織SOD，MDA含量。

1.7病理實(shí)驗(yàn) 神經(jīng)行為測(cè)試結(jié)束后，頸椎脫臼猝死，剝離顱骨至枕骨大孔以上，快速摘取全腦組織于冰皿上，迅速分離雙側(cè)大腦半球，取小鼠左側(cè)大腦組織用10%甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透、包埋后連續(xù)切片(厚度5 μm)，貼附于APES預(yù)處理過的載玻片上，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)VD小鼠的神經(jīng)行為學(xué)影響 在避暗試驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠進(jìn)入暗室潛伏期顯著縮短(P<0.05)、錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，各治療組進(jìn)入暗室的潛伏期顯著延長(P<0.05)、錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05)。與腦復(fù)康組相比，六味地黃湯組和天王補(bǔ)心湯組小鼠進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表1。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠從平臺(tái)跳下的潛伏期顯著縮短(P<0.05)，犯錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，各治療組小鼠從平臺(tái)跳下的潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)，犯錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與腦復(fù)康組相比，六味地黃湯組和天王補(bǔ)心湯組小鼠從平臺(tái)跳下的潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)；小鼠犯錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。見表2。在探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠到達(dá)暗室、高端以及明室時(shí)間均明顯延長(P<0.05)，爬高端的次數(shù)明顯減少(P<0.05)，在暗和明室的滯留時(shí)間有明顯差異(P<0.001)。與模型組相比，各治療組小鼠到達(dá)暗室、高端以及明室的時(shí)間均明顯縮短(P<0.05)，小鼠爬高端的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，在暗室和在明室的滯留時(shí)間無明顯差異(P﹥0.05)。與腦復(fù)康組相比，六味地黃湯組和天王補(bǔ)心湯組小鼠到達(dá)暗室、高端和明室的時(shí)間明顯縮短(P<0.05，P<0.01)；小鼠爬高端的次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表3。腦復(fù)康、六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯對(duì)小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶有改善作用，六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯對(duì)小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶的改善作用綜合優(yōu)于腦復(fù)康，天王補(bǔ)心湯對(duì)小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶的改善作用最明顯。

表1 六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)腦缺血再灌注小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響±s，n=15)

2.2六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)模型小鼠腦組織內(nèi)SOD、MDA的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦中SOD的含量均顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著增高(P<0.01)。與模型組相比，各治療組小鼠腦中SOD的含量均顯著增高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。與腦復(fù)康組相比，六味地黃湯組和天王補(bǔ)心湯組小鼠腦中SOD的含量均顯著增高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；其中，天王補(bǔ)心湯組小鼠腦中SOD的含量增高最明顯，MDA含量降低最明顯。

表2 六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)腦缺血再灌注小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響±s，n=15)

2.3六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯對(duì)模型組小鼠腦組織海馬神經(jīng)元形態(tài)影響 正常組和假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核及胞質(zhì)清晰，尼氏體形態(tài)正常。模型組腦組織出現(xiàn)以神經(jīng)細(xì)胞損傷、膠質(zhì)細(xì)胞增生、血管壁增厚為特征的病變。海馬區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，排列層次減少，伴有片狀軟化灶；大部分細(xì)胞核固縮深染，尼氏體減少或消失，胞體腫脹，出現(xiàn)了大量的空泡區(qū)；海馬內(nèi)側(cè)局部膠質(zhì)細(xì)胞增多，部分區(qū)域血管壁增厚。腦復(fù)康組大部分海馬錐體細(xì)胞恢復(fù)，排列較規(guī)整，部分細(xì)胞核固縮，散見有膠質(zhì)細(xì)胞。尼氏體部分恢復(fù)正常，僅有小部分溶解。六味地黃湯組海馬錐體細(xì)胞形態(tài)完好，排列整齊，但仍有少數(shù)細(xì)胞核固縮為三角形或多角形。尼氏體形態(tài)大致正常。天王補(bǔ)心湯組海馬錐體細(xì)胞僅有少量脫失，細(xì)胞核仁清晰可見，胞質(zhì)正常，仍可見少量膠質(zhì)細(xì)胞。尼氏體大部分形態(tài)正常。

表3 六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)腦缺血再灌注小鼠在探索實(shí)驗(yàn)中認(rèn)知探索功能的影響±s，n=15)

表4 六味地黃湯、天王補(bǔ)心湯對(duì)腦缺血再灌注小鼠腦中SOD、MDA含量的影響±s，n=15)

3 討 論

六味地黃湯由宋朝的錢乙所創(chuàng)立，是滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典方、代表方，由熟地24 g、山萸肉12 g、干山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g組成，原方用丸劑，本實(shí)驗(yàn)中為減小藥物劑型之間的差異性，統(tǒng)一改為湯劑使用，其功效為滋陰補(bǔ)腎，用治腎祛諸證。方中熟地、山萸肉、山藥三藥相配伍，功能滋養(yǎng)肝脾腎，以補(bǔ)腎陰為主。天王補(bǔ)心丹出自于《攝生秘剖》，由酸棗仁、柏子仁等13味中藥組成。全方共同起到滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)心安神的作用，用于治療心陰虛血少、神志不安證。

通過服用六味地黃湯，腎陰得到補(bǔ)充，陰精化生有源，腦髓得以充養(yǎng)，通過服用天王補(bǔ)心湯，心陰心血得到補(bǔ)充，神有所養(yǎng)，人的正常心理、意識(shí)和思維活動(dòng)得以正常進(jìn)行，二者均使得VD小鼠的認(rèn)知障礙得以緩解，學(xué)習(xí)記憶能力得到提高。

SOD是人體主要的抗氧化酶之一，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻斷自由基的毒性反應(yīng)〔8〕，清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，間接反映了機(jī)體自由基產(chǎn)生的量和體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，MDA的量常作為反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度的指標(biāo)〔9〕。通過對(duì)SOD、MDA含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯能夠明顯提高SOD活性，降低MDA的含量，對(duì)腦細(xì)胞起到保護(hù)作用，可見六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其作用機(jī)制可能是影響自由基的生成或清除，從而起到腦保護(hù)作用。通過光鏡觀察六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯對(duì)VD小鼠的病理形態(tài)學(xué)影響，發(fā)現(xiàn)大部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)較好，排列較為整齊，尼氏體形態(tài)大致正常，說明六味地黃湯和天王補(bǔ)心湯對(duì)VD小鼠的腦神經(jīng)元有顯著保護(hù)作用，其中天王補(bǔ)心湯對(duì)VD小鼠的治療作用優(yōu)于六味地黃湯。

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