基于VSIG4的腺病毒對1型糖尿病的治療

石雁冰 張?zhí)m舉 邢立志 張媛媛 馬桂潔 李樹法

(貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院門診部，貴州 貴陽 550002)

1型糖尿病(T1DM)是由淋巴細胞介導的以胰島β 細胞特異性損傷導致胰島素生成絕對不足為特征的一種自身免疫性疾病〔1, 2〕。目前T1DM以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，其費用高昂且副作用大，急需尋找一種特異性免疫干預策略〔3, 4〕。研究表明，誘導自身反應性CD8+T細胞的免疫耐受是一種有效的T1DM治療策略，可減緩甚至完全阻斷T1DM的發(fā)生和發(fā)展〔5, 6〕。含V-set和免疫球蛋白域4(VSIG4)是一種新發(fā)現(xiàn)的B7家族相關蛋白，具有抑制T細胞活化的作用，是一個有力的T細胞活化負調節(jié)分子〔7〕。在本實驗中，制備VSIG4腺病毒，并觀察對NOD小鼠的CD8+T 細胞的抑制效應和血糖水平的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 8月齡NOD小鼠購自北京醫(yī)科大學動物實驗中心。重組VSIG4 (Ad-VSIG4) 腺病毒和攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ) 基因的重組腺病毒(Ad-LacZ) 由上海生工制備。CD8+T 細胞分離試劑盒購自Miltenyi 公司。ELISPOT檢測干擾素(IFN)-γ試劑盒購于法國DIACLONE公司。其他為常用試劑。

1.2動物免疫 分別用含1×109pfu的Ad-VSIG4或Ad-LacZ的重組腺病毒及磷酸鹽緩沖液(PBS)分三組免疫8月齡NOD小鼠。背側尾根部皮下注射3次，間隔1 w。

1.3小鼠脾臟淋巴細胞懸液制備 NOD小鼠最后一次免疫后1 w，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟放于冷Hank液中，剪碎并反復碾磨通過200目的無菌銅網，收集懸液并用紅細胞溶解液去除紅細胞，再用大量Hank's 液洗滌細胞2次，1 200 r/min離心10 min，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計數(shù)。

1.4免疫磁珠分選(MACS) 純化CD8+T細胞 取4×107細胞，1 200 r/min 離心10 min，去上清液后用160 μl 緩沖液重懸，加40 μl 抗體Cocktail 充分混勻，4℃孵育10 min。加160 μl緩沖液，1 200 r /min離心10 min，去上清液，再加入320 μl 緩沖液、80 μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r /min離心10 min。吸除上清液，用500 μl 緩沖液重懸細胞， 200 目篩網過濾成無氣泡的單細胞懸液。將MACS細胞分離柱置于MACS 磁力架上，先用500 μl 緩沖液洗柱，再將細胞懸液通過MACS 柱，1 500 μl 緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細胞，計數(shù)。

1.5ELISPOT檢測 參照ELISPOT(IFN-γ)試劑盒使用說明書進行檢測。調整細胞為1×106個/ml，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞懸液，各設3個復孔，孵育48 h。陰性對照不加細胞孵育，計數(shù)各孔出現(xiàn)的色斑數(shù)目。

1.6淋巴細胞增殖能力檢測 調整細胞為1×106個/ml,于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞懸液，加入終濃度為IFN 100 μg/ml的insulin蛋白，培養(yǎng)72 h。每孔再加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS漂洗細胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預冷的體積分數(shù)為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，轉移入閃爍瓶中，加入5 ml 閃爍液，用液體閃爍計數(shù)器計數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測定DPM 值(反映細胞DNA 合成速率)，重復測定3 次。

1.7NOD小鼠血糖水平檢測 NOD小鼠最后一次免疫后1 w, 每2 w檢測血糖濃度，當連續(xù)2次的血糖濃度>11.1 mmol/L時，定義為糖尿病。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS10. 0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1ELISPOT檢測結果 實驗組小鼠CD8+T細胞的IFN-γ分泌數(shù)量為(44±6)個，而Ad-LacZ和PBS對照組的IFN-γ分泌數(shù)量為(99±14)個和(107±19)個。實驗證明VSIG4腺病毒能有效抑制NOD小鼠淋巴細胞的活化。

2.2淋巴細胞增殖結果 實驗組小鼠CD8+T細胞的cpm值為(36 700±2 900)，而Ad-LacZ和PBS對照組的cpm值為(50 600±5 700)和(53 500±6 600)。實驗證明VSIG4腺病毒能有效抑制NOD小鼠CD8+T細胞的增殖。

2.3血糖水平抑制結果 實驗組小鼠18周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率為30%，而對照組小鼠12周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率高達80%。實驗證實VSIG4腺病毒病能夠有效延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間，并降低糖尿病的發(fā)病率。見圖1。

圖1 各實驗組NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率

3 討 論

目前普遍認為T1DM是在遺傳和環(huán)境因素共同作用下，由T淋巴細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病〔8, 9〕。主要是由于免疫系統(tǒng)的異常，CD4+和CD8+T淋巴細胞對胰島的浸潤，引發(fā)胰島炎癥并導致對胰島β細胞的損傷，使胰島素分泌絕對減少，引起體內胰島素絕對缺乏從而導致血糖持續(xù)升高，產生T1DM〔10, 11〕。多種免疫機制參與T1DM的發(fā)病，為糖尿病的預防提供了途徑和方向。研究數(shù)據(jù)表明，應用免疫調節(jié)藥物和細胞等手段可以抑制胰島炎癥作用，減少β細胞的免疫破壞及凋亡，誘導特異性免疫耐受，從而達到預防及阻止糖尿病發(fā)病。

VSIG4又稱補體受體免疫球蛋白超家族分子CRIg，是一種新發(fā)現(xiàn)的B7家族相關蛋白。VSIG4的mRNA高表達于成人肺、胎盤、肝和心臟等組織，但VSIG4主要局限表達于巨噬細胞，在單核細胞中幾乎沒有表達，并且當巨噬細胞受外來刺激活化后VSIG4表達下調〔12〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，VSIG4是巨噬細胞上的補體受體，可結合補體C3的降解片段C3b和iC3b，對于病原體的吞噬起重要作用〔13〕。最近的研究顯示，VSIG4有抑制T細胞活化的作用，且作用強于PD-Ls/PD-1途徑，是一個有力的T細胞活化負調節(jié)分子〔14〕。但目前未有VSIG4抑制T1DM中CD8+T 細胞的活化的報道。

綜上所述，VSIG4腺病毒能抑制NOD小鼠體內CD8+T細胞介導的免疫應答，為T1DM的免疫耐受誘導治療提供了理論依據(jù)。

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