肝細胞肝癌NTS的表達與炎癥微環(huán)境形成和腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及預(yù)后的關(guān)系

李 凱 楊鎖萍 丁為民

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510282)

肝細胞肝癌〔1, 2〕(HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌。雖然對于早期HCC的治療采用手術(shù)切除治療有效，但術(shù)后復(fù)發(fā)率亦很高，主要原因是HCC的侵襲性較高，并且向肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移。有研究表明，肝臟炎癥和纖維化環(huán)境在HCC的發(fā)生中具有重大的影響，并且學(xué)者們對炎癥微環(huán)境〔3〕在促進腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮的作用也越來越關(guān)注。有研究證實，慢性炎癥和神經(jīng)降壓素/白介素-8(NTS/IL-8)炎癥通路活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促使結(jié)腸癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲〔4〕。本研究使用免疫組織化學(xué)法檢測NTS、炎癥相關(guān)因子以及EMT相關(guān)蛋白，旨在探討NTS和炎癥微環(huán)境在HCC轉(zhuǎn)移侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及預(yù)后的參考意義。

1 資料與方法

1.1對象選擇 選擇2011年8月至2013年10月來我院通過部分肝切除術(shù)術(shù)后病理確診為HCC患者78例，回顧性分析所有患者的資料，其中男42例，女36例；平均年齡(66.25±5.26)歲。患者臨床分期，36例Ⅰ期、22例Ⅱ期和20例Ⅲ期；按HBV感染分有45例無感染的，33例感染者；按有無飲酒史分為有21例無飲酒而56例有飲酒史的。所有患者術(shù)前均未接受其他放化療。術(shù)后進行隨訪24～38個月。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法〔5〕每個樣品均經(jīng)過常規(guī)脫蠟、修復(fù)抗原、去內(nèi)源性過氧化物酶和牛血清蛋白封閉，然后將準(zhǔn)備好的單克隆抗體(IL-8)、 基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-Cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)和波形蛋白(Vimentin)滴上，4℃下過夜充分結(jié)合，37℃下二抗反應(yīng)30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，用蘇木精復(fù)染?？瞻滋幚恚姿猁}緩沖液(PBS)取代一抗作為對照。所有樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察。每例標(biāo)本隨機選擇10個400倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞。

1.2.2評價指標(biāo) 細胞染色陽性率(PR)，染色陽性細胞所占的比例，陽性細胞為細胞質(zhì)或膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，范圍0～3，分別對應(yīng)≤10%、11%～30%、31%～60%和>60%。同時，按著色強弱，0～3表示無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色。蛋白低表達/不表達為這兩種評定方法合計分少于4分，否則為蛋白高表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計數(shù)資料使用χ2檢驗；計量資料兩組間比較使用t檢驗；多組采用方差分析；相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1NTS的表達和炎癥相關(guān)蛋白的情況 78例患者肝癌組織細胞質(zhì)中棕黃色顆粒NTS的表達陽性率是19.23%，15例標(biāo)本中NTS平均PR是(50.06±10.19)%；IL-8的表達陽性率是55.13%，43例標(biāo)本中NTS平均PR是(50.76±11.58)%；MMP-9表達陽性率是44.87%，平均PR(46.32±13.77)%，而VEGF的表達陽性率48.72%，平均PR(43.81±15.25)%。NTS陽性的標(biāo)本中有86.67%(13/15)表達IL-8，而NTS陰性的標(biāo)本中僅有47.62%(30/63)表達IL-8，且NTS與IL-8表達存在正相關(guān)關(guān)系(Rs=0.296,P=0.006)，HCC患者中NTS陽性組IL-8、MMP-9和VEGF的表達均顯著高于陰性組(P<0.05)。見表1。

2.2NTS的表達和EMT相關(guān)蛋白的情況 通過觀察NTS和IL-8表達均陽性的肝癌樣本，發(fā)現(xiàn)膜E-Cadherin丟失表達，而細胞質(zhì)中β-Catenin和Vimentin增加積累。經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者組織中的E-Cadherin和β-Catenin表達與IL-8表達水平存在關(guān)聯(lián)(R=0.302，0.259，P=0.302，0.031)，顯示在HCC中，NTS/IL-8炎癥通路的異?；罨瘜?dǎo)致升高表達的IL-8可能引起EMT。

表1 不同NTS表達組的IL-8、MMP-9和VEGF表達情況±s,%)

2.3NTS的表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系 78例HCC患者在不同乙型肝炎病毒(HBV)感染、飲酒史和臨床分期之間的總生存期OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，然而，對NTS和IL-8進行單因素分析發(fā)現(xiàn)，兩組對患者的生存期存在重要影響，NTS陽性組和IL-8陽性組患者生存期均短于陰性組(P<0.001)。見表2。

表2 HCC患者不同臨床參數(shù)對生存的影響±s)

3 討 論

HCC是全球最為常見的致死性惡性腫瘤之一，導(dǎo)致HCC發(fā)病的主要危險因子有飲酒、肝炎病毒、黃曲霉素B1攝入等〔6〕。由于我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)域，因而也是HBV相關(guān)性HCC的高發(fā)地區(qū)，HCC在我國的發(fā)病率位居前列。隨著社會和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類對HCC的發(fā)病機制、診斷技術(shù)及治療方法也取得一定的進步。但是對于大部分HCC患者來說，由于缺乏有效的早期診斷和病程判斷的標(biāo)志物往往確診后已失去手術(shù)機會，且術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率較大，極差的預(yù)后。近年來，有研究報道，約80%的HCC患者發(fā)生在病毒性肝炎引起的慢性炎癥和肝硬化的前提下，提示肝臟炎癥微環(huán)境對HCC的發(fā)生及發(fā)展起到重要作用〔3,7〕。文獻表明，NST作為一個含有13個氨基酸的神經(jīng)肽，它也是給惡性腫瘤提供生長信號的一種神經(jīng)內(nèi)分泌肽〔8〕。另外，有研究者支持，EMT不僅與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，還能促使腫瘤細胞獲得干細胞的特征，進而影響到腫瘤的預(yù)后〔9,10〕。

本研究提示NTS/ IL-8炎癥通路的活化促進腫瘤微環(huán)境中釋放多種炎癥因子。文獻報道，NTS在正常成熟的肝臟和原發(fā)性肝癌組織中不表達，在胎兒肝臟短暫表達〔11,12〕。本研究的結(jié)果意味著在一些肝癌標(biāo)本中存在NST異位表達，這與以往的研究結(jié)果一致。同時，提示NTS/ IL-8炎癥通路的異?；罨瘜?dǎo)致升高表達的IL-8可能引起EMT。EMT是一個上皮細胞經(jīng)過多次生化變化的生物過程，可具有一個間質(zhì)表型，這個表型是上皮源性癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要分子基礎(chǔ)〔13〕。本研究還發(fā)現(xiàn)NTS和IL-8對患者的生存期存在重要影響，提示NTS/ IL-8炎癥通路的異常激活影響患者術(shù)后預(yù)后效果，這可能是通路活化引起慢性炎癥和EMT的原因，最后引起HCC轉(zhuǎn)移和侵襲增加。

綜上所述，在HCC患者中存在NTS/ IL-8炎癥通路的異常激活，NTS的表達與炎癥微環(huán)境形成能促進腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及對患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

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