海南美登木對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響

宮愛民 楊世忠 馮 釗 許朝霞 燕海霞

(海南醫(yī)學院中醫(yī)學院中醫(yī)內科，海南 ?？?571101)

原發(fā)性肝癌居我國癌癥發(fā)病率的第3位，死亡率的第2位，廣西、海南等偏遠落后地區(qū)發(fā)病率偏高〔1〕。據(jù)統(tǒng)計〔2〕，中國80%的肝癌患者在不同時間段、不同程度接受中醫(yī)藥的治療，中藥在治療肝癌方面由于其療效肯定、副作用少、費用低等優(yōu)點，越來越受到國內外學者的重視。美登木屬(Maytenus)植物主產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)〔3〕，海南美登木(M.Hainanensis)性辛、苦、溫，歸肝經(jīng)，具有活血消癥功效，是臨床上用于治療肝癌的有效海南民族中草藥，自20世紀70年代開始，國內外學者相繼從美登木屬植物中分離提取到美登素、美登普林和美登布丁等抗腫瘤活性成分，并通過多年的實驗研究及臨床應用，證明其抗實驗動物瘤譜廣、有效劑量低、安全系數(shù)大，臨床實驗的結果表明美登木屬植物可治療肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤〔4,5〕。民間廣泛用作抗腫瘤的藥物〔6,7〕，有研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞的凋亡有密切關系，通過誘導癌細胞凋亡來治療各種惡性腫瘤是目前研究的熱點〔8〕。文獻〔9,10〕研究表明：活血消癥中藥抗腫瘤作用亦多從凋亡途徑進行深入研究。本研究觀察海南美登木含提取物對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響和治療肝癌的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 海南美登木，產(chǎn)地海南，購自萬寧藥用植物研究所。人源肝癌細胞HepG2，上海中醫(yī)藥大學肝病研究所贈予；哈爾濱醫(yī)科大學病理生理實驗室保存。光學成像顯微鏡 (上海光學儀器廠)；超凈工作臺 (蘇州安泰空氣技術公司)；MCO-17AICO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置顯微鏡 (上海光學儀器廠)；酶標儀(DG3022A日本產(chǎn))；旋轉蒸發(fā)器(DF-101S上海予正儀器設備有限公司)；多功能細胞分析系統(tǒng)(Becton Dickinson FACSort美國產(chǎn))；純水機 (SYJ-6HD，400GHL深圳產(chǎn))；熒光顯微鏡 (德國 Leica 公司)。優(yōu)等胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640(美國Gibco公司)；DMSO、MTT測定試劑盒、Hoechst33258 熒光染料、碘化丙啶 (美國Sigma公司 )；EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)(上海信然生物科技有限公司)等。

1.2海南美登木提取物制備 用12、10、8倍量的水分別提取20 g藥物1.5、1、1 h，合并過濾后的濾液，95%乙醇加入，使乙醇含量達80%，棄去放置過夜的上清液，冷凍干燥所收集的沉淀，制成凍干粉〔2,8〕。

1.3細胞培養(yǎng) 在含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中(含100 U/L青霉素和100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)HepG2細胞，37℃恒溫、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中2～3 d，消化傳代1次，用于實驗的為對數(shù)生長期細胞。

1.4海南美登木提取物的配制 稱10 mg海南美登木提取物凍干粉,1 ml DMSO溶解，微孔0.22 μm濾器過濾，配制成10 000 μg/ml濃度的母液，生理鹽水稀釋成濃度為800、600、400、200、100 μg/ml的溶液。

1.5Hoechst33258熒光染色爬片實驗 0.25%胰酶消化對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞后制成5×104個/ml的細胞懸液，于6孔板中放入滅菌的蓋玻片后加入200 μl/孔細胞懸液(加入細胞懸液前，可從蓋玻片側面輕輕吹進少量培養(yǎng)基，使蓋玻片和孔板底部貼合較緊密后，再加入細胞懸液，防止細胞爬片時，爬到蓋玻片背面)，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h之后，取出培養(yǎng)板加入海南美登木提取物 0、 10、40 μg/ml(每個濃度設兩個平行)，培養(yǎng) 24 h，吸掉孔板中的培養(yǎng)基后95%乙醇固定30 min，取出蓋玻片，用PBS液沖洗2遍，放到載玻片上，用移液槍吸取少量配制好的5 μg/ml Hoechst 33258滴于蓋玻片上，4℃ 避光染色15 min。PBS液沖洗2遍染色后的蓋玻片，滴1滴甘油在蓋玻片正面，將蓋玻片反扣于載玻片上在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.6MTT法檢測海南美登木提取物對肝癌HepG2細胞生長的影響〔1〕0.25%胰酶消化對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞后，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液(含10%滅活小牛血清 )將細胞制成2.0×104個/ml的細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板內，180 μl /孔，培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 12 h，分別加入不同濃度海南美登木提取物溶液20 μl于貼壁生長細胞中，分別達到80、60、40、20、10 μg/ml的藥物終濃度，加入20 μl RPMI1640 完全培養(yǎng)液為陰性對照組，180 μl RPMI1640 完 全培養(yǎng)液+20 μl生理鹽水為空白對照組，每組4個平行孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24、48及72 h后，倒置顯微鏡觀察藥物作用于腫瘤細胞后對其形態(tài)的影響，20 μl 5 mg/ml MTT溶液加入每孔后培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h，孔中培養(yǎng)液以翻板法棄去，加入150 μl DMSO，恒溫振蕩器(30℃)上避光搖勻10 min，492 nm 酶標儀測定各孔光密度值(OD)。按公式計算各時間點的IC50及細胞抑制率。抑制率(%)=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100。

1.7流式細胞儀分析細胞周期及凋亡 將HepG2細胞懸液按每孔1×104個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別用 0、20、60 μg/ml 的海南美登木提取物處理24 h，冷PBS洗收集的細胞2次，4℃冰箱中70%冷乙醇固定過夜。PBS洗固定后的細胞1次，5 000 r/min離心 5 min，0.3 ml PBS中重懸細胞，加入0.6 ml碘化丙啶溶液，避光染色4℃ 15 min，50 μm尼龍網(wǎng)過濾后，用流式細胞儀檢測有無凋亡峰，分析細胞周期。同樣調整HepG2細胞濃度 為1×104，種于 6 孔板 中，至對數(shù)生長期，分別用海南美登木提取物 0、20、60 μg/ml處理24 h，收集細胞，加入 5 L FITC Annexin V 和 5 L PI，輕微振蕩，室溫下(25℃)避光孵育15 min，加入400 μl 1×結合緩沖液，流式細胞儀檢測活細胞、壞死細胞、早期凋亡、晚期凋亡細胞百分比，計算凋亡率。

1.8統(tǒng)計學方法 使用SPSS15.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1海南美登木提取物對肝癌HepG2細胞的增殖影響 人肝癌HepG2細胞分別與不同濃度的海南美登木提取物作用24、48、72 h 后，呈時間和濃度依賴性作用于細胞增殖的抑制率均明顯高于陰性對照組 (P<0.01)，IC50值分別是24 h(32±1.06),48 h(57±0.148)、72 h(26 .95± 2.96)。

2.2藥物作用于腫瘤細胞后Hoechst33528 熒光染色顯示的形態(tài)變化 陰性對照組呈核均勻的圓形淺藍色細胞，10 μg/ml藥物處理組細胞呈核質固縮、體積縮小狀態(tài)，80 μg/ml藥物處理組核碎裂，核質明顯固縮，細胞皺縮，凋亡小體形成，為凋亡變化典型狀態(tài)。

2.3藥物作用于HepG2細胞后對其形態(tài)的影響 細胞旺盛生長，呈貼壁上皮樣，細胞呈扁平延展、細胞間連接緊密，細胞質均勻而透明，為陰性對照組表現(xiàn)。藥物處理后減少了腫瘤細胞的數(shù)量，且細胞脫壁漂浮，細胞間呈疏松連接，增強了細胞輪廓，呈變圓皺縮的表面狀態(tài)，細胞數(shù)量減少及形態(tài)變化與藥物呈濃度依賴性。

2.4海南美登木提取物對人肝癌HepG2細胞周期的影響 與0 μmol/L組比較， G0/G1期細胞比例在藥物處理組明顯降低 (P<0.01)；細胞G2/M期比例則明顯增加 (P<0.01)，S期細胞無明顯變化 (P>0.05)，各藥物處理組均可觀察到呈濃度依賴性的凋亡峰，見表1。

2.5海南美登木提取物對人肝癌 H ePG 細胞凋亡的影響 與0 μmol/L組相比，藥物處理組細胞凋亡率明顯呈濃度依賴性增加 (P

表1 海南美登木提取物對人肝癌HepG2細胞周期比例及凋亡率±s,%)

3 討 論

肝切除及肝移植是肝癌首選的治療方法，但其受到很多因素的制約?；煂Ω伟┬Ч患?，其毒副作用使其廣泛應用受到很大的限制。新的分子靶向藥物索拉非尼雖然可以延緩腫瘤進展，能一定程度上延長生存期，但該藥物價格較為昂貴，出現(xiàn)較嚴重不良反應，效果還需進一步評價。海南美登木提取物具有很多生物活性，如增強免疫等。本實驗結果表明海南美登木提取物呈時間、濃度依賴性顯著抑制HepG2肝癌細胞的增殖。腫瘤細胞的增殖生長周期被海南美登木提取物改變，腫瘤細胞阻滯在G2期，因而抑制了腫瘤細胞的增殖。海南美登木提取物對肝癌細胞具有良好的凋亡誘導作用。

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