雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1表達(dá)的影響研究

郭成永，梁朝輝，魏可欣，孫國(guó)柱，焦保華Δ，趙宗茂

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050011；2.保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北保定071000）

雷帕霉素對(duì)膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1表達(dá)的影響研究

郭成永1，梁朝輝1，魏可欣2，孫國(guó)柱1，焦保華1Δ，趙宗茂1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050011；2.保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北保定071000）

目的探討雷帕霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1(Tumor helicase RECQ1）表達(dá)的影響。方法選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤患者50例，隨機(jī)分為2組，其中對(duì)照組25例，予常規(guī)手術(shù)治療；實(shí)驗(yàn)組25例，先予以雷帕霉素膠囊，1mg，1次/天口服，連續(xù)服用14天，停藥后1周行手術(shù)治療。術(shù)中取膠質(zhì)瘤組織樣本，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR）技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組患者膠質(zhì)瘤組織瘤體解旋酶RECQ1 mRNA表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織明顯升高，對(duì)照組光密度值為(1.657±0.748），而實(shí)驗(yàn)組光密度值為(1.059±0.894），統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；所有組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白均有表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組患者的膠質(zhì)瘤組織中的瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達(dá)(0.952±0.021）明顯低于對(duì)照組(1.211±0.024），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論雷帕霉素膠囊能夠降低解旋酶RECQ1 mRNA表達(dá)，能夠抑制腦膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，有效殺滅癌細(xì)胞，控制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，改善預(yù)后，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

雷帕霉素；膠質(zhì)瘤；RECQ1

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）也稱(chēng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，根據(jù)起源的細(xì)胞成分分為星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，室管膜瘤，髓母細(xì)胞瘤，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［1］。本病臨床表現(xiàn)為顱內(nèi)壓增高癥狀如頭痛、視神經(jīng)乳頭水腫、嘔吐等以及腫瘤壓迫腦組織所表現(xiàn)出來(lái)的體征，如視覺(jué)障礙、感覺(jué)障礙、語(yǔ)言障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、病理反射陽(yáng)性等［2］。本病多發(fā)于20～50歲人群，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)［3］，我國(guó)原發(fā)性顱內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的年發(fā)病率為3.5～6.3/10萬(wàn)，并有逐年上升趨勢(shì)。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取手術(shù)治療等療法，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且術(shù)后并發(fā)癥嚴(yán)重，患者痛苦較大［4］。研究發(fā)現(xiàn)［5］，雷帕霉素能夠抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，阻止癌細(xì)胞的繁殖，為手術(shù)徹底切除癌細(xì)胞帶來(lái)可能，提高術(shù)后療效，緩解患者痛苦，減輕不良反應(yīng)，改善其預(yù)后等。通過(guò)觀(guān)察瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，來(lái)探究雷帕霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的臨床療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月～2013年8月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院以腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤為診斷而收入院患者50例，采用隨機(jī)數(shù)字表分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組25例，其中男19例，女6例，平均年齡（43.16±14.35）歲，星形細(xì)胞瘤10例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤3例，室管膜瘤6例，髓母細(xì)胞瘤1例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5例；對(duì)照組25例，其中男21例，女4例，平均年齡（44.01± 13.64）歲，星形細(xì)胞瘤11例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，室管膜瘤5例，髓母細(xì)胞瘤1例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4例。患者病程0.4～2.1年，平均病程（1.6±0.4）年。2組患者的一般資料相仿，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) ①臨床表現(xiàn)：顱內(nèi)壓增高癥狀如頭痛、視神經(jīng)乳頭水腫、嘔吐等；②體征：腫瘤壓迫腦組織所表現(xiàn)出來(lái)的體征，如視覺(jué)障礙、感覺(jué)障礙、語(yǔ)言障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、病理反射陽(yáng)性等；③CT或MRI可見(jiàn)腦組織占位性病變；④腫瘤標(biāo)記物NSE持續(xù)增高；⑤病灶組織病理活檢，是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，可明確診斷及區(qū)分病理級(jí)別［6］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者自愿參與本實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 心、肝、膽嚴(yán)重疾??；其他惡性腫瘤；患有艾滋病、病毒性肝炎等傳染病患者；神志異常以及近2個(gè)月來(lái)接受抗腫瘤治療的患者。

1.5 治療方法 50例患者入院后，行常規(guī)入院檢查，排除手術(shù)及麻醉禁忌癥，對(duì)照組行開(kāi)顱切除腦腫瘤手術(shù)，參照臨床用藥指南，術(shù)前給予雷帕霉素膠囊（華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100078），1mg，1次/天口服，連續(xù)服用14 d，停藥1周后行手術(shù)治療，手術(shù)方式、主刀醫(yī)生、器械護(hù)士與對(duì)照組相同。術(shù)中2組選取2組患者腦膠質(zhì)瘤組織，所有標(biāo)本采集后立即保存在-70℃深低溫冰箱中。

1.6 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 RNA提?。河肧YBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測(cè)人體腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。用超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取組織樣本中總RNA，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用紫外分光光度法測(cè)定RNA的含量。

表1 目的基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence of the target gene

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄：用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用。將2μL Primermix試劑和10μL消化后RNA分別加入20μL反應(yīng)體系的第一部分，混勻。65℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續(xù)向以上反應(yīng)管中加入4μL 5×RT Buffer、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP Each和1μL HiFi-MMLV Enzyme Mix試劑，輕輕吸打混勻，37℃孵育50min，70℃保溫10min。

1.6.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)定量分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，溴化乙啶染色，通過(guò)成像分析scion軟件計(jì)算和比較RECQ1產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與β-action條帶光密度值比較，計(jì)算出RECQ1在腦膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達(dá)含量。

1.6.4 Western blot分析：將準(zhǔn)備好的組織勻漿加入裂解液中，提取胞漿蛋白和膜蛋白進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后依次加RECQ1多克隆抗體和相應(yīng)的第二抗，洗膜，放射自顯影后，洗像。用圖像采集和分析系統(tǒng)采集分析圖片，測(cè)定2組的吸光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達(dá)RTPCR結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達(dá)較對(duì)照組腦膠質(zhì)瘤組織明顯減少，實(shí)驗(yàn)組光密度值為（1.059±0.894）；對(duì)照組相應(yīng)條帶吸收光密度值為（1.657± 0.748）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，2組瘤體解旋酶RECQ1mRNA表達(dá)比較存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.487，P＜0.05，見(jiàn)表2、圖1）。

表2 瘤體解旋酶RECQ1mRNA相對(duì)表達(dá)比較情況Tab.2 Comparison of tumor helicase RECQ1mRNA relative expression

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)RECQ1mRNA表達(dá)1-3，實(shí)驗(yàn)組；4-6，對(duì)照組Fig.1 Expression of RECQ1mRNA in brain glioma tissue 1-3，experiment group；4-6，control group

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1 Western blot結(jié)果

Western blot分析結(jié)果所示：2組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1均有蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達(dá)（0.952±0.021）顯著低于對(duì)照組（1.211± 0.024），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.684，P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果相同，如表3、圖2。

表3 腦膠質(zhì)瘤組織瘤體解旋酶RECQ1蛋白電泳帶的灰度值Tab.3 Electro phoresis brand gray value of brain glioma tumor helicase RECQ1 protein

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達(dá)（Western blot）1-2為實(shí)驗(yàn)組，3-5為對(duì)照組Fig.2 Expression of glioma tumor helicase RECQ1 protein 1-2，experiment group；3-5，control group

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，來(lái)源于神經(jīng)外胚層，其中以星形細(xì)胞瘤最常見(jiàn)，約占40%，其次為惡性度最高的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，約占20%。目前主要是以手術(shù)聯(lián)合放化療治療為主，但是手術(shù)難以根除，對(duì)放、化療不敏感，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后并發(fā)癥多，5年生存率低［7］。因此如何誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡、控制細(xì)胞增殖、治愈膠質(zhì)細(xì)胞瘤成為目前研究的熱點(diǎn)難題［8］。最近研究表明［9］，RECQ1在大腸癌、甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在高表達(dá)，并且RECQ1與惡性腫瘤患者預(yù)后差相關(guān)，因此如何抑制RECQ1，控制癌細(xì)胞的凋亡率，是現(xiàn)代治療腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤新的治療思路。

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達(dá)較對(duì)照組腦膠質(zhì)瘤組織明顯減少，實(shí)驗(yàn)組光密度值為（1.059±0.894）；對(duì)照組相應(yīng)條帶吸收光密度值為（1.657±0.748）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，2組瘤體解旋酶RECQ1mRNA表達(dá)比較存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot分析結(jié)果示：2組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1均有蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達(dá)（0.952±0.021）顯著低于對(duì)照組（1.211± 0.024），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果相同。RT-PCR和Western blot分析結(jié)果證明，雷帕霉素膠囊能夠抑制腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白的表達(dá)，控制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RecQ解旋酶是一類(lèi)參與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄重組以及RNA接拼、核糖體組裝、蛋白質(zhì)翻譯，端粒穩(wěn)定的核苷酸酶，而RECQ1是RecQ解旋酶家族成員，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)起到關(guān)鍵調(diào)控作用。雷帕霉素又稱(chēng)西羅莫司，是一種既能抑制細(xì)胞增殖從G1期進(jìn)入S期而阻斷T淋巴細(xì)胞活化，又能阻斷白細(xì)胞介素-2與其受體的結(jié)合的大環(huán)內(nèi)酯抗生素類(lèi)免疫抑制劑［10-13］。研究表明［14-15］，雷帕霉素又是mTOR抑制劑，mTOR是P13K/Akt信息通路激酶，在膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤增殖和發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用，雷帕霉素通過(guò)抑制mTOR激酶活性，阻斷P13K/Akt/mTOR信息通路在腫瘤細(xì)胞繁殖中的調(diào)控作用，起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)研究報(bào)道［16］，RECQ1表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，RECQ1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤低表達(dá)，因此雷帕霉素通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖，同時(shí)也抑制RECQ1表達(dá)。

綜上所述，雷帕霉素能夠抑制RECQ1mRNA和蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)，抑制mTOR激酶活性，阻止腫瘤細(xì)胞增殖和發(fā)展，有效殺滅腫瘤細(xì)胞，控制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，提高術(shù)后療效，降低復(fù)發(fā)率，改善患者生活質(zhì)量，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

［1］ 周福安.膠質(zhì)瘤PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白及基因遺傳學(xué)研究［D］.新疆醫(yī)科大學(xué)，2012.

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（編校：譚玲）

Effect study of rapamycin on the expression of tumor helicase RECQ1 in glioma patients

GUO Cheng-yong1，LIANG Zhao-hui1，WEIKe-xin2，SUN Guo-zhu1，JIAO Bao-hua1Δ，ZHAO Zong-mao1

（1.Department of Neurosurgery，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of rapamycin on the expression of glioma patients tumor helicase RECQ1.Methods50 glioma patients admitted to the department of neurosurgery in second hospital of hebeimedical university were selected and random ly divided into 2 groups，25 patients in control group，were treated with routine admission surgical treatment；25 cases in the experimental group，firstly were given rapamycin capsule 1mg，1 times/day orally，took 14 days in a row，and had surgical treatmentafter stopping drug aweek.Glioma tissue sampleswere taken during the operation，mRNA and protein expression of tumor helicase RECQ1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot.ResultsGlioma tumor helicase RECQ1 mRNA expression in the control group increased more significantly than experimental group，the optical density value in control group was（1.657±0.748），while the experimental group optical density valuewas（1.059±0.894），and the difference was statistically significant（P＜0.05）；allorganizations had the expression of tumor helicase RECQ1 protein，butgliomas tumor helicase RECQ1 protein expression in the experimental group patients（0.952±0.021）was significantly lower than that in the control group（1.211±0.024），and the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionRapamycin capsule could reduce the expression ofmRNA helicase RECQ1，inhibitDNA glial tumor cells of brain replication，effectively kill cancer cells，control the the progress of brain glioma，and improve prognosis，worth clinical promotion.

rapamycin；glioma；tumors helicase RECQ1

R730

A

1005-1678(2014）07-0138-03

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目（20130511）

郭成永，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：膠質(zhì)瘤，E-mail：onegcyong@126.com；焦保華，通信作者，女，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：膠質(zhì)瘤，E-mail：jiaobh2000@163.com。