DLL4蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義

楊瑞，張國(guó)新

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南南陽473000；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)系，江蘇南京210029）

DLL4蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義

楊瑞1，張國(guó)新2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南南陽473000；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)系，江蘇南京210029）

目的探討細(xì)胞跨膜Notch配體4(delta-like ligand 4，DLL4）蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義。方法選取2010年12月～2013年9月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因卵巢囊腫行腹腔鏡手術(shù)治療的患者83例，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組。A組：83例患者中取部分囊壁經(jīng)HE染色后納入48例；B組：83例患者中有37例因生育要求同時(shí)行宮腔鏡手術(shù)，排除子宮內(nèi)膜病變，取宮腔在位內(nèi)膜。采用1985年美國(guó)生育協(xié)會(huì)修正標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS）進(jìn)行臨床分期，A組：21例Ⅰ～Ⅱ期患者，27例Ⅲ～Ⅳ期患者；B組：16例Ⅰ～Ⅱ期患者，21例Ⅲ～Ⅳ期患者。C組：選取同期婦科因縱隔子宮行宮腔鏡下子宮縱隔電切術(shù)患者30例。采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)A、B2組中DLL4蛋白的表達(dá)并與C組比較，同時(shí)分析DLL4蛋白與EMs分期的關(guān)系。結(jié)果A、B、C 3組中，DLL4的平均積分光密度(IOD）值分別為(144.99±10.12）、(115.42±10.39）、(90.08±7.29），組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=314.22，P＜0.05）。A、B 2組中Ⅰ～Ⅱ期DLL4蛋白的表達(dá)均顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(P＜0.05）。結(jié)論DLL4蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。

子宮內(nèi)膜異位癥；細(xì)胞跨膜Notch配體4；免疫組化

子宮內(nèi)膜異位癥是由于種植的內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)于不正確的位置而造成的婦科疾病，發(fā)病率較高，在臨床上較為常見。不僅患者在發(fā)病時(shí)可以感覺到月經(jīng)異常以及腹痛等癥狀，而且不孕不育也是其臨床癥狀之一［1-2］。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，新血管形成在此病的發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)DLL4蛋白存在于哺乳動(dòng)物中，是Notch信號(hào)途徑中的重要配體［4］，與體內(nèi)血管生成關(guān)系十分密切。本次研究探討DLL4蛋白在EMs發(fā)生、發(fā)展中的作用，為EMs的發(fā)病機(jī)制和臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2010年12月～2013年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因卵巢囊腫行腹腔鏡手術(shù)治療的83例患者為研究對(duì)象，病理切片診斷均為卵巢巧克力囊”，年齡25～45歲，平均年齡（33.6±6.5）歲。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B 2組。A組：取卵巢巧克力囊腫的囊壁，納入48例；B組：83例患者中37例因有生育要求同時(shí)行宮腔鏡手術(shù)，排除子宮內(nèi)膜病變，取宮腔在位內(nèi)膜。臨床分期采用1985年美國(guó)生育協(xié)會(huì)修正標(biāo)準(zhǔn)（r-AFS）進(jìn)行：A組：21例Ⅰ～Ⅱ期患者，27例Ⅲ～Ⅳ期患者；B組：16例Ⅰ～Ⅱ期患者，21例Ⅲ～Ⅳ期患者。對(duì)照組（C組）：選取同期婦科因縱隔子宮行宮腔鏡下子宮縱隔電切術(shù)患者30例，年齡24～45歲，平均年齡（32.6±6.7）歲，排除子宮內(nèi)膜病變，取子宮內(nèi)膜。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)［5-7］：所有研究對(duì)象均處于月經(jīng)周期的增殖期，患者初潮年齡、月經(jīng)史等基本資料完整、病歷記錄詳盡，研究前均簽署了知情同意書，并且經(jīng)醫(yī)院相關(guān)倫理委員批準(zhǔn)。研究對(duì)象均沒有糖尿病、高血壓等內(nèi)外科合并癥及內(nèi)分泌疾??；術(shù)前各指標(biāo)（血常規(guī)、肝腎功能、心電圖）均正常；術(shù)前均檢測(cè)血清CA125等腫瘤標(biāo)志物；月經(jīng)周期規(guī)律，為（28～35）d，排除子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜病變和生殖道炎癥等其他婦科疾病，且半年內(nèi)均未行激素治療。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選取2010年12月～2013年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因卵巢囊腫行腹腔鏡手術(shù)治療的83例患者為研究對(duì)象，病理切片診斷均為卵巢巧克力囊腫，DLL4蛋白在EMs患者的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)測(cè)定采用免疫組織化學(xué)S-P法，并與對(duì)照組正常內(nèi)膜對(duì)比，同時(shí)分析DLL4與EMs臨床分期的關(guān)系。用鏈菌素親生物素蛋白-過氧化物酶連接法（labelled streptavidin biotin method，LSAB），即S-P法檢測(cè)組織中DLL4蛋白。①玻片處理：將載玻片和蓋玻片先用清洗液除去血液、油脂等雜質(zhì)，然后分別放入盛有0.9%氯化鈉溶液的器皿中浸泡1 d，水洗，甩干，防止玻片上留有水印，再用95%酒精浸泡2 d拭干備用。②切片制作：每1病例蠟塊連續(xù)切片4張（4 μm），1張切片用于HE染色，用于一般形態(tài)學(xué)觀察，1張切片用于S-P免疫組化染色，以檢測(cè)DLL4蛋白在3種組織中的表達(dá)，2張備用。10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。③免疫組化染色：60℃烤箱烤片2 h，二甲苯脫蠟15min×2次、梯度酒精水化、入蒸餾水5min，PBS液沖洗2min×2次、抗原熱修復(fù)、拿出后自然條件下冷卻、對(duì)內(nèi)源性過氧化酶進(jìn)行阻斷、然后顯色、梯度酒精脫水、二甲苯透明完全后中性樹膠封片。兔抗人DLL4多克隆抗體由北京博奧森生物工程有限公司生產(chǎn)（工作濃度均為1：100），S-P實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，每例標(biāo)本染色后均經(jīng)專業(yè)病理醫(yī)生確診。PBS緩沖液替代一抗試劑作陰性對(duì)照，已知陽性切片做陽性對(duì)照。

1.4 檢測(cè)結(jié)果分析 以組織的腺上皮細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)、胞核或細(xì)胞膜呈現(xiàn)黃色、棕黃色或深棕色顆粒為陽性信號(hào)；顯微鏡下對(duì)組織切片全面觀察，采用全自動(dòng)病理圖像分析系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6）分析切片，每張切片隨機(jī)選取視野5個(gè)，以平均積分光密度（IOD）值表示蛋白的表達(dá)強(qiáng)度；每次閱片前校正光密度，并保持每張切片的白平衡、光線等參數(shù)不變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用±s”表示，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；正態(tài)計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞是DLL4蛋白表達(dá)的主要場(chǎng)所，極少量表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，不計(jì)入IOD分析（見圖1）。

圖1 子宮內(nèi)膜的DLL4蛋白免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical results of DLL4 protein in endometrium

2.1 DLL4蛋白在A、B、C3組中的表達(dá) DLL4蛋白在A、B、C 3組中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=314.220；P＜0.05）；經(jīng)LSD檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組蛋白表達(dá)顯著高于B組和C組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為13.202、25.802，P＜0.05）；B組蛋白表達(dá)水平顯著高于C組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=11.287，P＜0.05）

表1 A、B、C組中DLL4蛋白的表達(dá)比較Tab.1 Comparison of DLL4 protein expression among group A，B and C

2.2 A、B 2組中DLL4蛋白在EMs不同分期的表達(dá) A組中DLL4蛋白在Ⅰ～Ⅱ期的表達(dá)均明顯低于Ⅲ～Ⅳ期（t=-7.375，P＜0.05），B組中DLL4蛋白在Ⅰ～Ⅱ期的表達(dá)均明顯低于Ⅲ～Ⅳ期（t=-5.578，P＜0.05，見表2）。

表2 A、B組中DLL4蛋白在EMs不同分期的表達(dá)比較Tab.2 Comparison of DLL4 protein expression in EMs between group A and group B at different stages

3 討論

隨著科技發(fā)展帶來的環(huán)境污染，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率也有上升的趨勢(shì)，并且越來越年輕化［5-6］。它是由于種植的內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)于不正確的位置而造成的婦科疾病，在臨床上較為常見。子宮腔本應(yīng)是內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)之處，但是盆腔與輸卵管相連通的結(jié)構(gòu)使得內(nèi)膜細(xì)胞有進(jìn)入盆腔而進(jìn)行異位生長(zhǎng)的可能性。子宮內(nèi)膜異位癥是導(dǎo)致不孕不育的常見原因之一，近年來已有很多關(guān)于其病因、診斷、治療的研究，而且在診斷和治療等方面也取得一定進(jìn)展，但其發(fā)病機(jī)制一直不明，對(duì)其治療也造成一定的障礙。有研究表明［7］，異位新生血管形成是子宮內(nèi)膜異位癥機(jī)制之一。最近研究發(fā)現(xiàn)［8］，DLL4蛋白存在于哺乳動(dòng)物中，是Notch信號(hào)途徑中的重要配體。作為一種高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，Notch信號(hào)系統(tǒng)是由細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子、Notch配體以及Notch受體組成的［9］。研究發(fā)現(xiàn)，可抑制血管內(nèi)皮頂端細(xì)胞形成的DLL4蛋白，其主要原理是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞位置、行為方式以及密度，高效促進(jìn)血管網(wǎng)的形成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常分化［10］。研究報(bào)道表明：DLL4的抑制表達(dá)也抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管網(wǎng)絡(luò)的形成［11］。同時(shí)，Ridgway等［12］阻斷DLL4的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腫瘤新生血管多處于無功能狀態(tài)，而已有的正常血管不受影響。在以往的研究中，DLL4蛋白被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異表達(dá)［13］，然而，最近的一些研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌、胰腺癌、肺癌等大多數(shù)惡性腫瘤組織中，DLL4蛋白均存在上調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象，而且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素密切相關(guān)［14-15］。但關(guān)于其在EMs組織中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道［16］。

本次研究DLL4蛋白在EMs患者的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)，并與對(duì)照組正常內(nèi)膜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞是DLL4蛋白表達(dá)的主要場(chǎng)所，極少量表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中DLL4的平均IOD值高于對(duì)照組（P＜0.05）；且異位內(nèi)膜中DLL4蛋白的表達(dá)顯著高于在位內(nèi)膜，說明DLL4可能參與了EMs的發(fā)生、發(fā)展。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中，DLL4蛋白的表達(dá)量均隨EMs臨床分期的增加而升高（P＜0.05），這進(jìn)一步證實(shí)，DLL4參與了EMs的發(fā)生過程，且在EMs的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。DLL4可能通過調(diào)控EMs發(fā)病過程中新生血管的分化與成熟，提高有效血管的生成率，從而使疾病狀態(tài)持續(xù)，并為疾病進(jìn)展創(chuàng)造有利條件。

綜上所述，本研究初步證實(shí)DLL4蛋白在子宮內(nèi)膜異位組織中存在高表達(dá)，可促進(jìn)子宮異位內(nèi)膜微血管的生成，并與子宮內(nèi)膜異位癥的臨床分期有關(guān)。因此，我們推測(cè)DLL4可能成為EMs抗血管治療的一個(gè)新的理想靶點(diǎn)，可作為判斷子宮內(nèi)膜異位癥治療療效的一個(gè)指標(biāo)，為進(jìn)一步為通過減少DLL4蛋白表達(dá)來治療子宮內(nèi)膜異位癥開辟新的途徑。

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（編校：王儼儼）

Expression and significance of DLL4 protein in endometriosis

YANG Rui1，ZHANG Guo-xin2

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Nanyang City Center Hospital，Nanyang 473000，China；2.Department of Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of DLL4 in endometriosis.Methods83 cases due to ovarian cyst surgery from December 2010 to September 2013，were selected in the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，and were random ly divided into two groups in accordance with the random number table.Group A：48 caseswere induded after staining from 83 patientswhowere tahen a part of cystwall；Group B：of laparoscopic ovarian cyst surgery in 83 patients，37 cases of simultaneously hysteroscopy due to fertility requirements，exclude endometrial lesions，were taken reign uterine endometrium.The American fertility association revised standard（r-AFS）in 1985 was used to divide the clinical stage：Group A：21 cases ofⅠ～Ⅱstage，27 cases ofⅢ～Ⅳ；Group B：16 cases ofⅠ～Ⅱstage，21 cases ofⅢ～Ⅳstage；Group C：30 cases hysteroscopic uterine septum resection with electricity due to lower mediastinal uterus were selected at the same period.The expression levels of DLL4 protein in Group A，B were detected by S-Pmethod，and compared with the control group（Group C），then analyze its relationship with EMs stage.ResultsIn Group A，B and C，the expression of DLL4 protein were（144.99±10.12），（115.42±10.39），（90.08±7.29），and there were significantly diffiences among three groups（F=314.220，P＜0.05）；The expression of DLL4 protein atⅠ～Ⅱstagewere significantly lower than that inⅢ～Ⅳstage（P＜0.05）.ConclusionDLL4 protein may play an important role in the pathogenisis of endometriosis.

endometriosis；DLL4；immunohistochemical

R711.71

A

1005-1678(2014）07-0096-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072032）

楊瑞，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：qch18214600111@163.com。