iRGD 修飾脂質(zhì)體的制備及其結(jié)腸癌靶向性研究

鐘玲，李思齊，楊蔚，曾蓉，毛琴，陳嘉勇Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明650500；2.云南省第一人民醫(yī)院急診科，云南昆明650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，云南昆明650101）

iRGD 修飾脂質(zhì)體的制備及其結(jié)腸癌靶向性研究

鐘玲1，2，李思齊3，楊蔚2，曾蓉2，毛琴2，陳嘉勇3Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明650500；2.云南省第一人民醫(yī)院急診科，云南昆明650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，云南昆明650101）

目的制備iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP），研究其結(jié)腸癌靶向性。方法采用薄膜分散法制備iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP），研究脂質(zhì)體的粒徑和電位；通過定性和定量細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)研究結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對普通脂質(zhì)體(LP）和iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP）的攝取效率。構(gòu)建結(jié)腸癌RKO細(xì)胞腫瘤球模型，研究脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力；構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠異位模型，研究iRGDLP的體內(nèi)分布。結(jié)果iRGD-LP的粒徑為(109.4±12.9）nm，電位為(4.2±1.47）mV；結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝取效率是LP的3.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）；細(xì)胞腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示iRGD-LP具有良好的腫瘤細(xì)胞靶向性。結(jié)論iRGD修飾脂質(zhì)體是一種潛在高效的結(jié)腸癌靶向給藥系統(tǒng)。

結(jié)腸癌；脂質(zhì)體；藥物靶向；iRGD

在過去幾十年，隨著現(xiàn)代生物研究的發(fā)展，腫瘤疾病的治療手段也日益豐富。根據(jù)腫瘤組織的特點(diǎn)進(jìn)行靶向治療成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［1］。整合素受體（integrins receptors）在黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，因此整合素αvβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點(diǎn)［2-5］。iRGD是一條序列為CRGDRGPDC的多肽片段，它既能有效識(shí)別整合素受體又能高效穿過細(xì)胞膜［6］。本研究將iRGD連接到脂質(zhì)體的表面，研究其對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向性，為進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Leica 7CSSP5雙掃描激光共聚焦顯微鏡（Leica公司）；大豆磷脂（SPC）和DSPE-PEG2000（美國Avanti材料公司）；iRGD（上海吉爾生化公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；香豆素-6（coumarin-6，美國sigma公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；人源結(jié)腸癌細(xì)胞（RKO，上海細(xì)胞研究所）；雄性裸鼠20～25g（成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物合格證號(hào)：DSDW2013-022）。

1.2 方法

1.2.1 iRGD修飾脂質(zhì)體的制備：參照文獻(xiàn)方法［7-9］合成iRGD-PEG2000-DSPE。精密稱取適量SPC，膽固醇，DSPEPEG2000-OMe，iRGD-PEG2000-DSPE，香豆素-6或DIR，將以上材料溶于氯仿中，減壓蒸發(fā)后加入2 mL PBS水化得到iRGD修飾脂質(zhì)體（iRGD-LP）。取適量樣品用粒度儀測定其粒徑以及電位。

1.2.2 RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝?。簩KO細(xì)胞以5× 105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，24 h后，加入適量LP和iRGDLP，使孔中脂質(zhì)體濃度為120 nmol/L，37℃分別孵育2 h和4 h后，冷PBS沖洗2次，流式細(xì)胞儀檢測各樣品的熒光強(qiáng)度。將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，冷PBS沖洗2次，每孔加入4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，加入2μg/mL DAPI溶液，遮光染色5 min，冷PBS沖洗2次，甘油封片保存。共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3 iRGD-LP的腫瘤球穿透能力：參照文獻(xiàn)方法［7］培養(yǎng)細(xì)胞腫瘤球，分別加入適量LP和iRGD-LP，使孔中脂質(zhì)體濃度為120 nmol/L。37℃孵育4 h后，冷PBS沖洗2次，甘油封片保存。共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 裸鼠異位瘤的構(gòu)建：取體質(zhì)量20～25 g的雄性裸鼠，將RKO細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，7 d后出現(xiàn)米粒大腫瘤證實(shí)接種成功。取建模成功后的裸鼠尾靜脈注射1.2.1項(xiàng)下制備的載DIR脂質(zhì)體0.1mL，24 h后，置于近紅外活體成像下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，多組間樣本均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iRGD-LP的表征 制備得到的iRGD-LP和LP表征結(jié)果見表1。

表1 脂質(zhì)體的表征（n=3）Tab.1 Characteristics of liposomes（n=3）

2.2 RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝取 體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞共孵育8h后，RKO細(xì)胞對iRGD-LP攝取效率是普通脂質(zhì)體的3.2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。RKO細(xì)胞對iRGD-LP攝取隨著孵育時(shí)間延長而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。共聚焦結(jié)果顯示：iRGDLP組在細(xì)胞核周圍綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于LP組（見圖1）。

表2 RKO細(xì)胞對不同脂質(zhì)體的攝取效率（n=3）Tab.2 Uptake of different liposomes by RKO cells（n=3）

圖1 激光共聚焦觀察RKO細(xì)胞對載香豆素-6脂質(zhì)體的攝取.Fig.1 Uptake of coumarin-6 loaded liposome by RKO cells based on confocal laser scanningmicroscopy

2.3 iRGD-LP對RKO細(xì)胞腫瘤球的穿透作用 腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：iRGD-LP組在腫瘤中綠色熒光明顯強(qiáng)于LP組（見圖2），說明iRGD能夠有效增強(qiáng)脂質(zhì)體對腫瘤球的穿透作用。

圖2 載香豆素-6脂質(zhì)體對RKO細(xì)胞腫瘤球的穿透實(shí)驗(yàn)Fig.2 Uptake of coumarin-6 loaded liposomes by RKO tumor spheroids based on confocal laser scanningmicroscopy

2.4 體內(nèi)活體成像 荷瘤裸鼠活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：iRGD修飾脂質(zhì)體組的荷瘤裸鼠腫瘤組織熒光最強(qiáng)，明顯強(qiáng)于LP（見圖3）。

圖3 載DIR的不同類型的脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布Fig.3 EX vivo images of given various DIR loaded liposomes

3 討論

研究表明，具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RGD能夠顯示出和整合素αvβ3、αvβ5的高度親和力［10-12］。其與整合素αvβ3的親和力約為線性RGD的1000倍［13-15］。國內(nèi)外許多研究者都利用RGD與整合素αvβ3的特異性結(jié)合將抗腫瘤藥物或載藥體系選擇性地傳遞至腫瘤部位發(fā)揮藥效［16］。細(xì)胞穿膜肽是一種能夠穿透一切細(xì)胞膜的短肽鏈，無細(xì)胞選擇性。iRGD是一條同時(shí)具有RGD和穿膜肽作用的多肽，能夠識(shí)別整合素受體，同時(shí)高效發(fā)揮穿膜肽作用［17］。本研究將iRGD連接到脂質(zhì)體表面，從體內(nèi)外對其結(jié)腸癌靶向性進(jìn)行評價(jià)。

本研究結(jié)果顯示：制備得到的脂質(zhì)體的粒徑為110 nm左右。本研究通過定性和定量的細(xì)胞攝取和熒光脂質(zhì)體的腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)來考察iRGD修飾的脂質(zhì)體與結(jié)腸癌細(xì)胞的親和力及對實(shí)體腫瘤的穿透作用，結(jié)果顯示：iRGD修飾的脂質(zhì)體具有良好的結(jié)腸癌細(xì)胞親和力和靶向性，經(jīng)過iRGD修飾后增強(qiáng)了脂質(zhì)體對實(shí)體瘤的穿透作用。本研究還構(gòu)建了結(jié)腸癌異位腫瘤模型，研究iRGD修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)分布，結(jié)果顯示：經(jīng)過iRGD修飾后，脂質(zhì)體能夠更好的靶向至腫瘤組織。

綜上所述，本研究制備的iRGD修飾脂質(zhì)體是一種潛在有效的結(jié)腸癌細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

［1］ Alessia C，Isabella O，Silvia D.Transferrin receptor 2 is frequently expressed in human cancer cell lines［J］.Blood Cells，Molecules，and Diseases，2007，39(1）：82-91.

［2］Shah N.Paclitaxel-loaded PLGA nanparticles surface modified with transferrin and Pluronic-P85，an in vitro cell line and in vivo biodistribution studies on ratmodel［J］.JDrug Target，2009，17(7）：533-542.

［3］Raymond M.Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature［J］.Journal of liposome research，2002，12(8）：129-135.

［4］Xiong XB.Enhanced intracellular uptake of sterically stabilized liposomal doxorubicin［J］.Pharmaceutical Research，2005，6(5）：933-939.

［5］Oba M.Cyclic RGD peptide-conjugated polyplex micelles as atargetable gene delivery system directed to cells possessingαvβ3 and αvβ5 integrins［J］.BioconjugChem 2007，18(5）：1415-1423.

［6］Teesalu T，Sugahara KN，Kotamraju VR，et al.C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell，vascular，and tissue penetration［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106(38）：16157-16162.

［7］Yao Q.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeuticefficacy on brain glioma in animals［J］.International Journal of Pharmaceutics，2011，420(2）：304-312.

［8］Kuai，R.Efficient delivery of payload into tumor cells in a controlled manner by TAT and thiolytic cleavable PEG co-modified liposomes［J］.Mol Pharmaceutics，2010，7(5），1816-1826.

［9］Kuai R.Targeted delivery of cargoes into a murine solid tumor by a cell-penetrating peptide and cleavable poly(ethylene glycol）comodified liposomal delivery system via systemic administration［J］. Mol Pharmaceutics，2011，8(6），2151-2161.

［10］Ying X.Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals［J］.Journal of Controlled Release，2010，141(2）：183-192.

［11］Chang SF.Targeted microbubbles for ultrasound mediated gene transfection and apoptosis induction in ovarian cancer cells［J］. Ultrasonics Sonochemistry，2013，20(1）：171-179.

［12］Garcia-Garcia E，Andrieux K，Gil S，et al.Colloidal carriers and Blood brain barrier(BBB）translocation：a way to deliver drugs to the brain［J］.Int JPharm，2005，298(2）：274-292.

［13］Gao HL.A cascade targeting strategy for brain neuroglial cells employing nanoparticlesmodified with angiopep-2 peptide and EGFPEGF1 protein［J］.Biomaterials，2011，32(33）：8669-8675。

［14］Li Z.Lipid-polymer hybrid nanoparticles：synthesis，characterization and applications［J］.Nano LIFE，2010，1(1）：163-173.

［15］Li J，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an L，et al.Targeting the brain with PEGPLGA nanoparticles modified with phage-displayed peptides［J］. Biomaterials，2011，32(21）：4943-4950.

［16］Zhan C，Gu B，Xie C.Cyclic RGD conjugated poly(ethyleneglycol）-copoly(lactic acid）micelle enhances paclitaxel anti-glioblastoma effect［J］.JControl Release，2010，143(1）：136-142.

［17］Chang J，Jallouli Y.Characterization of endocytosis of transferrin-coated PLGA nanoparticles by the blood-brain barrier［J］.Int JPharm，2009，379(2）：285-292.

（編校：吳茜）

Preparation of iRGD modified liposome and its targeting to colon cancer cell

ZHONG Ling1，2，LISi-qi3，YANGWei2，ZENG Rong2，MAO Qin2，CHEN Jia-yong3Δ

（1.Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2.Department of Emergency，The First People's Hospital of Yunnan Province，Kunming 650032，China；3.Department of Emergency，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical
University，Kunming 650101，China）

ObjectiveTo prepare iRGDmodified liposome（iRGD-LP）and evaluate their targeting efficiency in vitro and in vivo to colon cancer cell.MethodsThe iRGD-LPwas prepared by film-ultrasonicmethod，its particle size and Zeta potentialwere evaluated.The cellular uptake efficiency of RKO cell to LP and iRGD-LPwere evaluated in vitro and in vivo.Tumor spheroid model were constructed and the penetration efficiency of solid tumor were evaluated.Ectopic colon cancer nudemicemodel was constructed，and iRGD-LP distribution in the rat body were studied.ResultsThe particle diameter of iRGD-LPwas（109.4±12.9）nm with the Zeta potential of（4.2±1.47）mV.The cellular uptake efficiency of RKO cell to iRGD-LP were 3.2 times higher than thatof LP（P＜0.01）.The tumor spheroid penetration testand iRGD-LP distribution in vivo imaging results showed iRGD-LP had the strongest fluorescence intensity.Conclusion The iRGD-LPmight serve as a promising colon cancer delivery system of antitumor drugs.

colon cancer；liposome；drug targeting；iRGD

R735.3

A

1005-1678(2014）07-0069-03

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2011FA029）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2010CD165）

鐘玲，女，博士在讀，研究方向：胃腸道腫瘤，E-mail：zhongl87189812@163.com；陳嘉勇，通信作者，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：胃腸道腫瘤，E-mail：xiaosha.dogy@163.com。

book=71,ebook=74