包裹125 I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

王風(fēng)秀，王加芬，陸小偉

（1.濱州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濱州256600；2.濱州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州256600；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

王風(fēng)秀1，王加芬2，陸小偉3

（1.濱州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濱州256600；2.濱州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州256600；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

目的探討納米二氧化硅是否可作為生物大分子藥物口服載體。方法研究鈣離子的量對(duì)二氧化硅納米顆粒形態(tài)的影響、不同鈣離子存在下二氧化硅納米顆粒對(duì)蛋白或多肽的包裹率、蛋白或多肽從二氧化硅納米顆粒中釋放情況、二氧化硅包裹蛋白酶解情況、以及二氧化硅納米顆粒包裹125I標(biāo)記多肽在小鼠體內(nèi)釋放情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明合成的二氧化硅納米顆粒包裹多肽在小白鼠體內(nèi)可以順利通過胃酸到達(dá)小腸，有作為生物活性大分子口服藥物載體的潛力。結(jié)論蛋白或多肽比較容易在堿性條件下釋放，在pH 2的酸性條件下釋放極少(胃酸的pH值），制備的二氧化硅納米顆粒有作為口服藥物載體的潛力。

納米二氧化硅；藥物口服系統(tǒng)；蛋白質(zhì)和多肽

包裹良好、性能穩(wěn)定且在酸性條件下不易釋放的二氧化硅納米顆粒，其良好的性能可能作為口服藥物載體［1-3］。為了研究其是否能用作口服藥物載體，將進(jìn)一步研究包裹多肽的二氧化硅納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布情況?，F(xiàn)有的常規(guī)分析手段很難檢測生物體內(nèi)的二氧化硅納米顆粒［4］，而放射性示蹤技術(shù)卻可以簡單有效地解決這個(gè)問題。目前，已經(jīng)有多種放射性同位素被用于研究材料的生物分布，包括14C、111In、86Y、64Cu、99mTc和125I等，這些材料均可以用來標(biāo)記化合物作為一種示蹤劑或分析試劑，可以用來測定機(jī)體內(nèi)微量物質(zhì)的濃度，是具有很高靈敏度的示蹤與分析方法。參照放射性同位素標(biāo)記蛋白的方法，選用具有適中半衰期（60.2天）的125I來標(biāo)記多肽［5］。

1 材料與方法

1.1 試劑 FITC-GDDYHHHHHH＞95%50mg上海科肽生物科技有限公司；Na125I（無載體）/原子高科股份有限公司；偏正亞硫酸鈉AR 500 g國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮AR 500mL國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Iodogen/蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；三氯甲烷AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；G15填料100 g Sigma-Aldrich；紙薄層色譜/興萬電子廠；環(huán)己烷AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己醇AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Triton X-100 GR Sigma-Aldrich；氯化鈣AR 500 g國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TEOSGR Sigma-Aldrich；氨水GR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯胺-T＞99%100 g北京中諾泰安科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本文實(shí)驗(yàn)部分主要是做了以下實(shí)驗(yàn)：氯胺-T法125I標(biāo)記多肽；Iodogen法125I標(biāo)記多肽；包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒實(shí)驗(yàn)；包裹125I與多肽的簡單混合液實(shí)驗(yàn)；包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒體外釋放實(shí)驗(yàn)；包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 FITC-GDDYHHHHHH的125I標(biāo)記 FITC-GDDYHHHHHH峰位置的確定：為了大致確定FITC-GDDYHHHHHH淋洗的出峰位置，在相同的淋洗條件下，用G15柱分離FITC-GDDYHHHHHH。樣品一加入凝膠柱便開始收集淋洗液。將每管的液體分別用紫外分光光度計(jì)測其在495 nm處的吸收。由圖知道進(jìn)樣后，淋洗7mL左右FITC-GDDYHHHHHH開始出峰。

圖1 FITC-GDDYHHHHHH的淋洗曲線Fig.1 The elution curve of FITC-GDDYHHHHHH solution

125I標(biāo)記FITC-GDDYHHHHHH的制備：圖2和圖3給出了反應(yīng)后混合溶液的淋洗曲線。其中圖2為Iodogen法標(biāo)記多肽的淋洗曲線，圖3為氯胺-T法標(biāo)記多肽的淋洗曲線。圖中的縱坐標(biāo)為樣品的相對(duì)計(jì)數(shù)率（counts permin，cpm），橫坐標(biāo)為淋出液樣品體積。從圖2中只得到一個(gè)峰；從圖3中能看到2個(gè)分得很開的峰。根據(jù)流出體積與空白試驗(yàn)比較確定第一個(gè)峰是FITC-GDDYHHHHHH出峰的位置，是標(biāo)記產(chǎn)物；第二個(gè)峰是小分子峰，主要是游離的碘離子。

圖2 Iodogen法125 I標(biāo)記FITC-GDDYHHHHHH反應(yīng)混合液的淋洗曲線Fig.2 Elution curve on a Sephadex G-15 column of a reaction mixture solution of FITC-GDDYHHHHHH and Na125 Ioxidized by iodogen

為了確定第一個(gè)峰是經(jīng)過反應(yīng)而得到的穩(wěn)定的125I-FITCGDDYHHHHHH，而不是125I靠吸附或者其他非共價(jià)的作用結(jié)合到FITC-GDDYHHHHHH上，將Na125I溶液和FITCGDDYHHHHHH溶液簡單混合，放置5～20min后用與標(biāo)記反應(yīng)相同的淋洗條件淋洗，得到圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的放射性都出現(xiàn)在后面的小分子峰位置，而前面FITC-GDDYHHHHHH應(yīng)該出現(xiàn)的位置沒有測到放射性。

圖3 氯胺-T法125 I標(biāo)記FITC-GDDYHHHHHH反應(yīng)混合液的淋洗曲線Fig.3 Elution curve on a Sephadex G-15 column of a reaction mixture solution of FITC-GDDYHHHHHH and Na125 Ioxidized by chloramine-T

圖4 Na125 I和FITC-GDDYHHHHHH的簡單混合的淋洗曲線Fig.4 Elution curve on a Sephadex G-15 column of a simplemixture solution of FITC-GDDYHHHHHH and Na125 I

125I-FITC-GDDYHHHHHH的放化純度和穩(wěn)定性檢測：將經(jīng)淋洗純化后的125I-FITC-GDDYHHHHHHH溶液放置3天，用紙薄層色譜檢測標(biāo)記物的放化純度和穩(wěn)定性。用丙酮/水的體積比為10：1的溶液為展開劑，室溫下展開，取出晾干，將薄層色版平均分成7等分的紙條，依次用γ計(jì)數(shù)器測其放射性。γ計(jì)數(shù)器的本底為50 cpm，放置3天后的穩(wěn)定性為（678.41-50）/（678.41 +73+62+83.5+85.07+53-50·7）=97%。由此可見，標(biāo)記化合物相當(dāng)穩(wěn)定，沒有發(fā)生明顯的125I脫落。

2.2 包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒的制備 將FITC-GDDYHHHHHH與無載體的Na125I簡單混合后，用同樣的包裹條件反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，同樣將丙酮、乙醇、pH 2 PBS清洗后的上清液進(jìn)行放射性檢測，結(jié)果如表1，可見經(jīng)過依次清洗后，被二氧化硅納米顆粒包裹的125I放射性小于0.36%，因此可以得出二氧化硅納米顆粒對(duì)無載體Na125I的吸附影響很小，可以忽略不計(jì)。

表1 納米顆粒溶液各部分放射情況Tab.1 Nanoparticle solution of each part of the radiological situation

125I-FITC-GDDYHHHHHH穩(wěn)定性檢測：將經(jīng)過丙酮，乙醇，pH 2緩沖液清洗后的125I-FITC-GDDYHHHHHH樣品用紙薄層色譜檢測標(biāo)記物的放化純度和穩(wěn)定性。用丙酮/水的體積比為10：1的溶液為展開劑，室溫下展開，取出晾干，將薄層色版平均分成六等分的紙條，依次用γ計(jì)數(shù)器測其放射性。γ計(jì)數(shù)器的本底為50 cpm，放置3天后的穩(wěn)定性為：（773.78-20）/（773.78+ 40.88+19.37+42.4+24.36+11.92-20.6）=95%。

125I-FITC-GDDYHHHHHH樣品濃度的測定：將125I-FITCGDDYHHHHHH樣品用20mL PBS pH 7.5溶解，取0.5mL再加入0.5mL PBS溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測量其紫外吸收，得到320 nm時(shí)A=1.02288，由此知0.5 mL的二氧化硅納米顆粒溶液中含有0.360mg二氧化硅，則20mL體積中共有14.4mg二氧化硅納米顆粒。

2.3 包裹125I標(biāo)記多肽的二氧化硅納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布 圖5中給出的是二氧化硅納米顆粒包裹125I標(biāo)記的FITCGDDYHHHHHH在小白鼠體內(nèi)的釋放情況，由圖可以看出，放射性的125I大部分分布在小腸和大腸中，少部分進(jìn)入血液和其它組織。為了檢測自由的125I在小白鼠體內(nèi)的分布情況，將無載體的Na125I經(jīng)口服灌胃進(jìn)入小白鼠體內(nèi)，結(jié)果如圖6所示，大部分的125I都經(jīng)膀胱由尿液排出體外，只有極少部分存在其它各組織、器官中。比較圖5與6，看出，包裹125I標(biāo)記的FITC-GDDYHHHHHH實(shí)驗(yàn)中，甲狀腺中沒有檢測到放射性，同時(shí)血液中放射性含量也很低。

圖5 125 I-FITC-GDDYHHHHHH在小白鼠體內(nèi)分布Fig.5 The biodistribution of 125 I-FITC-GDDYHHHHHH in mouse

圖6 Na125 I在小白鼠體內(nèi)分布比較Fig.6 The biodistribution of Na125 I in mouse

3 討論

125I的標(biāo)記方法：125I的標(biāo)記方法有很多種，但應(yīng)用較多的是氯胺-T法，Iodegen法，乳過氧化物酶法，固相氧化法，連接標(biāo)記法等［6-8］。采用用于標(biāo)記蛋白較多的兩種方法：氯胺-T法和Iodegen法相比較來得到最簡單有效的標(biāo)記方法［9-10］。氯胺-T法具有操作簡單、標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑易得等優(yōu)點(diǎn)，因而迅速被廣泛使用，如今仍然是實(shí)驗(yàn)室最常用的碘化方法之一［11-12］。氯胺-T（Chloramine-T）即N-氯代對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽，是一種比較溫和的氧化劑，在水溶液中水解產(chǎn)生次氯酸，后者使碘離子氧化成活潑的碘分子，然后碘分子取代被標(biāo)記物上的可被碘原子結(jié)合的基團(tuán)，從而生成碘標(biāo)記化合物［13］。碘與被結(jié)合基團(tuán)之間以共價(jià)鍵的形式結(jié)合。此反應(yīng)受多種因素影響：氯胺-T的用量；酸堿度，最佳pH值一般在7～8之間；反應(yīng)體積，50～300μL比較好；反應(yīng)溫度和時(shí)間，室溫下反應(yīng)幾分鐘即可，對(duì)于非活性被標(biāo)記物，時(shí)間可長些。

Iodogen是一種與氯胺-T同屬氯酰胺類化合物的新型碘化劑，難溶于水，故可溶于有機(jī)溶劑，涂于管底，并使之干燥。用Iogogen為氧化劑，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記，把125I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記過程中被標(biāo)記樣品與Iogogen混合，標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng)，不使用任何還原劑［14］。同樣反應(yīng)受多種因素影響：碘化時(shí)間，碘化反應(yīng)時(shí)間7 min時(shí)標(biāo)記率達(dá)最高，10 min時(shí)略有減少；酸堿度，pH為6.0～8.5時(shí)，標(biāo)記率最高；125I與被標(biāo)記物的分子之比，碘化時(shí)，當(dāng)125I與多肽分子之比為1～1.2時(shí)標(biāo)記率較佳；Iodogen與蛋白質(zhì)的比率是標(biāo)記率的函數(shù)，最大的標(biāo)記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比［15］。

由本文實(shí)驗(yàn)中可以看出Iodogen法不能成功的標(biāo)記多肽FITC-GDDYHHHHHH而氯胺-T法比較適合標(biāo)記此條多肽且標(biāo)記率很高。同時(shí)，在得到的標(biāo)記化合物中，125I與FITCGDDYHHHHHH間的作用并非是吸附或其它弱的非共價(jià)相互作用，而應(yīng)該是共價(jià)化學(xué)反應(yīng)。通過比較Iodogen法和氯胺-T法碘標(biāo)FITC-GDDYHHHHHH的比較，采用了氯胺-T法制備了FITCGDDYHHHHHH的125I標(biāo)記物并證明碘原子通過共價(jià)鍵與多肽結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明標(biāo)記物的放化純度高，穩(wěn)定性好，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多肽在胃液中釋放量很少，和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)說明納米二氧化硅包裹多肽能夠保護(hù)多肽免于胃酸的破壞。但血液中放射量低也說明在小腸中的釋放吸收不好，這也是蛋白質(zhì)和多肽的共同問題，需要通過進(jìn)一步添加吸收促進(jìn)劑來改進(jìn)。

本研究證實(shí)鈣離子在一定濃度范圍內(nèi)可以明顯提高納米二氧化硅包裹多肽的能力，當(dāng)超過一定濃度范圍鈣離子則會(huì)破壞反應(yīng)的微乳體系。蛋白或多肽比較容易在堿性條件下釋放，在pH 2的酸性條件下釋放極少（這也是胃酸的pH大?。苽涞亩趸杓{米顆粒有作為口服藥物載體的潛力。

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（編校：譚玲）

Animal experiment study of silica nanoparticles labeled peptides w ith125I

WANG Feng-xiu1，WANG Jia-fen2，LU Xiao-wei3

（1.Department of Pharmacy，Binzhou People's Hospital，Binzhou 256600，China；2.Department of Laboratory，Binzhou People's Hospital，Binzhou 256600，China；3.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study whether the silica nanoparticles can be used as a biomacromolecular carrier of oral drugs.MethodsStudyed the influence of the amount of calcium ions on nano silica nanoparticlesmorphology，the encapsulation rate of silica nanoparticles on proteins or peptides in the presence of different calcium ions，the situation of proteins or peptides released from silica nanoparticles，enzymolysis of protein packaged by silica，silica nanoparticles labeled peptideswith125I released inmice.ResultsExperiments showed that the synthetic silica nanoparticles packaged with peptides could smoothly reach the small intestine through the gastric acid in mice，it had potential to be biomacromolecular carrier of oral drug.ConclusionProteins or peptides is easy to release in alkaline condition，but release few in acidic condition of pH2（PH of gastric acid）.The silica nanoparticles prepared have the potential to be oral drug carrier.

silica nanoparticles；oral drug system；protein and peptide

R318.08

A

1005-1678(2014）07-0066-04

國家自然科學(xué)基金（81100858）

王風(fēng)秀，女，本科，副主任藥師，研究方向：藥學(xué)方面，郵箱：qch1821460075@163.com。