帕瑞昔布對肝部分切除大鼠海馬炎癥反應的影響及可能機制

李鐵軍，印春銘Δ，蔡淑女

（1.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省腫瘤醫(yī)院普外科，浙江杭州310000）

帕瑞昔布對肝部分切除大鼠海馬炎癥反應的影響及可能機制

李鐵軍1，印春銘1Δ，蔡淑女2

（1.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省腫瘤醫(yī)院普外科，浙江杭州310000）

目的研究帕瑞昔布對肝部分切除后大鼠海馬炎癥反應的影響及可能機制。方法選取72只SPF級雄性健康SD大鼠，隨機分為對照組(C組）、麻醉組(A組）、手術組(S組）、帕瑞昔布組(P組）4組，每組18只。采用肝部分切除術建立手術創(chuàng)傷致海馬炎癥動物模型。麻醉后1、3、7 d處死大鼠，檢測海馬組織炎癥介質(zhì)的表達。采用實時定量PCR檢測環(huán)氧合酶-2(COX-2）mRNA的表達量，Western blot檢測COX-2、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3）的蛋白表達量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA）檢測前列腺素E2(PGE2）的含量。結(jié)果與C組相比，A組大鼠海馬組織中COX-2表達(蛋白、mRNA），PGE2含量，Caspase-3蛋白表達均差異均無統(tǒng)計學意義；S組、P組大鼠術后第1、3天COX-2，PGE2，Caspase-3表達均明顯上調(diào)(P＜0.05，P＜0.01），尤以術后第1天明顯(P＜0.01），術后第7天上述各炎癥指標表達恢復正常。與S組相比，P組術后第1、3天COX-2，PGE2，Caspase-3表達明顯下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論肝部分切除術可導致海馬炎癥反應，帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應，其機制可能與下調(diào)海馬COX-2 mRNA和蛋白表達，降低PGE2含量和Caspase-3蛋白表達有關。

帕瑞昔布；COX-2；Caspase-3；海馬；炎癥

術后認知功能障礙（post-operative cognitive dysfunction，POCD）多表現(xiàn)為焦慮，精神錯亂，學習和記憶功能減退。POCD可持續(xù)數(shù)周，數(shù)月甚至數(shù)年，嚴重者可發(fā)展為癡呆［1-3］。與POCD的死亡率相關的數(shù)據(jù)令人感到不安。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，與未患POCD的病人相比，在術后前3個月患POCD的病人死亡率更高［4］。因此，近年來POCD越來越受到關注，成為研究熱點。老年癡呆癥、帕金森病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究顯示［5］，COX-2抑制劑可抑制中樞炎癥反應從而起到神經(jīng)保護作用。那么COX-2是否參與手術應激引起的海馬炎癥反應？COX-2抑制劑能否抑制這種炎癥？本研究旨在針對以上問題進行探討，為手術應激后海馬炎癥反應的防治提供實驗依據(jù)，使其成為治療POCD的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：本實驗選取72只SPF級雄性健康SD大鼠，月齡12月，體質(zhì)量（500±50）g，購買于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，動物合格證號SCXK（鄂）2012-0005，在武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心由專人飼養(yǎng)于有通風設施的恒溫動物房，嚴格控制光照周期為12 h，自由進食和飲水。

1.1.2 試劑和儀器：MLS-85C型電泳槽（北京康來公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；ZHWY100A恒溫搖床（沃德生物儀器）；DY89-I型電動勻漿器（寧波新芝科器研究所）；電子天平BT224S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；pH計（美國Cole-Parmer公司）；HH-60三用數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱（中國國華公司）；ABI Prism7500型實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；-20℃冰箱（中國海爾公司）；超低溫冰箱（美國Forma Scientific公司）；MR23i高速多功能冷凍離心機（法國JOUAN公司）；HR-PCR-96G梯度PCR儀（中國青島海爾集團）；Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；紫外分光光度計DU530（美國Beckman公司）；酶標儀RT-6000（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；恒溫箱（重慶永恒實驗儀器廠）。

大鼠PGE2 ELISA試劑盒（上海信然生物技術有限公司）；βactin抗體（美國Santa Cruz公司）；COX-2抗體、Caspase-3抗體（Cell Signaling公司）；兔抗鼠二抗（KPL公司）；苯甲基磺酰氟（德國Serva公司）；脫氧鵝膽酸（美國Sigma公司）；預染Marker（普利萊基因技術公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）（Pierce公司）；化學發(fā)光試劑盒ECL（碧云天公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組給藥：72只SPF級雄性健康SD大鼠，隨機分為4組：對照組（C組，n=18）、麻醉組（A組，n=18）、手術組（S組，n=18）、帕瑞昔布組（P組，n=18）。采用肝部分切除術建立手術創(chuàng)傷導致海馬炎癥的動物模型。C組大鼠腹腔注射生理鹽水3mL。A組大鼠腹腔注射戊巴比妥40 mg/kg加芬太尼40μg/kg麻醉。S組大鼠腹腔注射與A組等量的麻醉藥后行肝部分切除術。P組大鼠腹腔注射與A組等量的麻醉藥后行肝部分切除術，并于術前0.5 h腹腔注射帕瑞昔布鈉10mg/kg，術后每天腹腔注射帕瑞昔布鈉2mg/kg直至處死，其他各組均腹腔注射等量生理鹽水。麻醉后1、3、7 d處死大鼠，檢測海馬組織炎癥介質(zhì)的表達。采用實時定量PCR檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）mRNA的表達量，Western blot檢測COX-2、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的蛋白表達量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測前列腺素E2（PGE2）的含量。

1.2.2 動物模型的建立：手術時間為上午8點至10點，手術室溫度穩(wěn)定在20℃～25℃，術前1天對手術室進行紫外線消毒，對手術器械及敷料進行高溫高壓蒸汽滅菌，術前動物禁食12h。大鼠腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40μg/kg（藥物總體積為3mL）進行麻醉，當大鼠角膜反射遲鈍，翻正反射消失，呼吸深慢，表明大鼠已進入麻醉狀態(tài)。用4根繩子將手術動物固定于鼠板上，用1根細絲線固定牙齒，并用一塊干凈的敷料墊高腹部便于暴露。剪去大鼠腹部毛發(fā)備皮，行心電監(jiān)護，活力碘消毒后鋪無菌巾。行劍突下直切口，長約2～3 cm，游離肝左葉，并用小止血鉗夾閉肝左葉動、靜脈。在止血鉗下用3號縫線結(jié)扎2次，沿止血鉗上緣切下肝左葉。用37℃溫鹽水沖洗腹部2次以減少污染，用無菌紗布擦干。整理臟器位置，用小圓針單純連續(xù)縫合肌層?；盍Φ庀?，小三角針單純間斷縫皮。傷口處用0.25%布比卡因局部浸潤麻醉以緩解傷口疼痛，用小敷貼包扎傷口。分別于手術開始前，手術結(jié)束時和手術1 h皮下注射1 mL生理鹽水以替代失液失血。術中嚴格無菌操作，對大鼠實行心電監(jiān)護以保證其生命體征平穩(wěn)。麻醉過程中將大鼠舌頭拉出口腔，間斷抽吸呼吸道分泌物，以保證其呼吸道通暢。待動物完全蘇醒后放入籠中飼養(yǎng)。每天在傷口處擦拭活力碘進行消毒，并及時更換傷口敷料直至處死。

1.2.3 檢測指標：COX-2 mRNA和蛋白表達測定：每組取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40 ug/kg麻醉后，斷頭處死并參照大鼠腦立體定位圖譜，在冰盤上分離出海馬組織，迅速凍存于-70℃冰箱以備后續(xù)檢測。本實驗采用實時定量PCR檢測大鼠海馬COX-2的mRNA的表達，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

PGE2的含量測定：每組各取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40 ug/kg麻醉后，斷頭處死并參照大鼠腦立體定位圖譜，在冰盤上分離出海馬組織，并迅速凍存于-70℃冰箱以備后續(xù)ELISA檢測。ELISA操作步驟均嚴格按照所購買試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 For Windows XP統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)“±s”來表示，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麻醉和手術對大鼠海馬COX-2 mRNA和蛋白表達的影響 與對照組相比，麻醉組各時點COX-2 mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（見圖1）。

手術組大鼠術后第1、3天COX-2 mRNA和蛋白表達較對照組明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），尤以術后第1天明顯（P＜0.01），并于術后第7天恢復正常。帕瑞昔布組大鼠術后第1天COX-2 mRNA和蛋白表達較對照組明顯上調(diào)（P＜0.01），于術后第3天恢復正常。與手術組相比，帕瑞昔布組術后第1、3天COX-2 mRNA和蛋白表達均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，見圖2）。

圖2 手術對大鼠海馬COX-2 mRNA（A）和蛋白（B）表達的影響C：對照組；S1：第1天手術組；S3：第3天手術組；S7第7天手術組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時間點S組比較Fig.2 Effect of operation on rat hippocampal COX-2 mRNA（A）and protein（B）expressionC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib**P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

2.2 麻醉和手術對大鼠海馬PGE2含量的影響 與對照組相比，麻醉組各時點PGE2含量無顯著差異。手術組和帕瑞昔布組大鼠術后第1、3天PGE2含量較對照組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），尤以術后第1天明顯（P＜0.01）。與手術組相比，帕瑞昔布組術后第1、3天PGE2含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，見圖3）。

圖3 手術對大鼠海馬PGE2含量的影響C：對照組；S1：第1天手術組；S3：第3天手術組；S7第7天手術組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時間點S組比較Fig.3 Effects of operation on the content of PGE2 in the hippocampus of ratsC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib **P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

2.3 麻醉和手術對大鼠海馬Caspase-3蛋白表達的影響與對照組相比，麻醉組各時點Caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（見圖4）。

圖4 麻醉對大鼠海馬Caspase-3蛋白表達的影響C：對照組；A1：第1天麻醉組；A3：第3天麻醉組；A7：第7天麻醉組Fig.1 Effect of anesthesia on rat hippocampalCaspase-3 protein expressionC：control group；A1：1 day after anesthesia；A3：3 days after anesthesia；A7 group：7 days after anesthesia

手術組和帕瑞昔布組大鼠術后第1、3天Caspase-3蛋白表達較對照組明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），尤以術后第1天明顯（P＜0.01）。與手術組相比，帕瑞昔布組術后第1、3天Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，見圖5）。

圖5 手術對大鼠海馬Caspase-3蛋白表達的影響C：對照組；S1：第1天手術組；S3：第3天手術組；S7第7天手術組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時間點S組比較Fig.5 Effect of operation on the expression of Caspase-3 protein in hippocampus of ratsC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib **P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

3 討論

肝部分切除術是一種研究POCD發(fā)生機制及病理變化的有效動物模型［6-8］。近期的一些研究發(fā)現(xiàn)，肝部分切除術后急性期（一般為術后7 d內(nèi)）和一定的時間范圍內(nèi)（術后30 d），實驗動物會出現(xiàn)不同程度的學習和記憶功能下降等認知功能減退的表現(xiàn)，與此同時動物海馬發(fā)生與認知功能減退相應的炎癥反應［9-12］。在海馬組織中可檢測到炎癥因子如TNF-α，IL-1β等表達顯著上調(diào)的炎癥表現(xiàn)，并有相應的形態(tài)學證據(jù)證明海馬炎癥反應的存在［13］。帕瑞昔布鈉是目前臨床上廣泛應用的特異性COX-2抑制劑之一［14］。動物腹腔注射帕瑞昔布鈉后，藥物可迅速吸收入血，并能快速通過血腦屏障發(fā)揮其藥理學作用［15］。本研究采用肝部分切除術建立手術創(chuàng)傷導致海馬炎癥反應的模型，并觀察圍術期使用特異性COX-2抑制劑帕瑞昔布鈉對海馬炎癥反應的影響。本實驗的結(jié)果說明手術干預即肝部分切除術可引起海馬炎癥反應并可能通過激活Caspase-3啟動神經(jīng)元細胞凋亡反應。術后第1天和術后第3天在相同時間點與手術組相比較，術后給藥組COX-2的mRNA和蛋白表達表達水平顯著降低。這提示藥物干預即帕瑞昔布鈉的運用可顯著下調(diào)COX-2在基因水平和蛋白質(zhì)水平上的表達并通過調(diào)控其下游因子從而達到減輕海馬炎癥反應的作用。對照組大鼠海馬COX-2的mRNA表達和蛋白表達與第7天各組和第3天P組的mRNA表達和蛋白表達無顯著差異，且低于其他各組COX-2的mRNA的表達和蛋白表達。隨著時間推移各組大鼠海馬COX-2的mRNA和蛋白的表達趨于恢復正常。說明肝部分切除術后的海馬炎癥反應在沒有藥物干預的情況下在術后第1天達到高峰，于術后第7天恢復。而運用帕瑞昔布鈉干預后于術后第3天或者更早的時間恢復。

本研究發(fā)現(xiàn)，麻醉組大鼠與對照組大鼠海馬COX-2mRNA和蛋白表達，PGE2含量，Caspase-3的蛋白表達均無顯著差異。這表明，麻醉因素在本研究中對肝切除術后大鼠海馬炎癥反應無顯著影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠海馬COX-2的mRNA和蛋白表達表達水平在運用帕瑞昔布鈉干預后于術后第3天或者更早的時間恢復，而PGE2含量，Caspase-3的蛋白表達則在術后第3天并未恢復正常。它們之間存在著一個時間上的延遲。這個現(xiàn)象提示PGE2，Caspase-3可能是COX-2的下游因子。

綜上所述，肝部分切除術可導致海馬炎癥反應，帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應，其機制可能與下調(diào)海馬COX-2mRNA和蛋白表達，降低PGE2含量和Caspase-3蛋白表達有關，且得出以下結(jié)論：①大鼠肝部分切除術可導致短暫的海馬炎癥反應；②帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應，其機制可能與下調(diào)海馬COX-2mRNA和蛋白表達，PGE2含量和Caspase-3的蛋白表達有關。

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（編校：吳茜）

Effect of parecoxib on hippocampal inflammation in partial hepatectomy rats and its possiblemechanism

LITie-jun1，YIN Chun-ming1Δ，CAIShu-nv2

（1.Department of Anesthesiology，The Fourth Hospital Affiliated to China Medical University，Jianping 110032，China；2.Department of General Surgery，The Tumor Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of parecoxib on hippocampal inflammation following partial hepatectomy in rats.Methods72 SPF male healthy SD ratswere selected and random ly divided into four groups：control group（group C），anesthesia group（group A），operation group（group S），parecoxib group（group P），each had 18 rats.Using partial hepatectomy operation trauma to establish animal model of hippocampal inflammation.Ratswere sacrificed 1，3，7 days after anesthesia，the expression of inflammatory mediators in hippocampal tissue were detected.The expression of cyclooxygenase-2（COX-2）mRNA were detected by real-time quantitative PCR，and COX-2 and cysteine proteinase-3（Caspase-3）protein expression were detected by Western blot，the prostaglandin E2（PGE2）contentwere detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsCompared with control group，COX-2 expression（protein and mRNA），PGE2 production and Caspase-3 protein expression in group A had no significant difference.In group S and P，COX-2 expression，PGE2 and Caspase-3 protein expression increased significantly on 1st day postoperatively to 3rd day（P＜0.05 or P＜0.01），and they were obvious especially in the postoperative 1st day（P＜0.01）.The above inflammation index expression returned to normal in 7th days after operation.Compared with group S，COX-2 expression，PGE2 and Caspase-3 protein expression increased significantly on 1stday postoperatively to 3rd day（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionPartial hepatectomy could induce hippocampal inflammatory response in the rats. Parecoxib could suppress the hippocampal inflammation via the down-regulation expression of COX-2mRNA and protein，PGE2 and Caspase-3 protein in rats.

parecoxib；COX-2；Caspase-3；hippocampus；inflammation

R687.4

A

1005-1678(2014）07-0061-05

浙江省衛(wèi)生廳（2012KYB032）

李鐵軍，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉，E-mail：qch1821460032@163.com；印春銘，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：麻醉藥與氣道防御，E-mail：qch1821460200@163.com。