大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706增殖及凋亡基因表達的影響分析

陳永東，邵中夫

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣東廣州510095）

大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706增殖及凋亡基因表達的影響分析

陳永東，邵中夫

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣東廣州510095）

目的研究分析大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706的增殖及對凋亡基因表達的影響。方法不同濃度的大蒜素前藥分為A1組(10μg/m L）、A2組(20μg/m L）、A3組(40μg/m L）、A4組(生理鹽水，0μg/mL）共4組，分別作用于食管癌細胞Eca9706，在培養(yǎng)1、2、3 d后，用MTT比色法(噻唑藍）檢測細胞增殖情況，實時熒光定量(RT-PCR法）檢測4組細胞p53基因在mRNA水平表達情況。結(jié)果大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706的增值抑制的最佳濃度為20μg/mL，最佳抑制時間為2 d，其對食管癌細胞Eca9706基因水平的抑制呈劑量依賴性。結(jié)論大蒜素前藥可以有效抑制食管癌細胞Eca9706的增值，通過對凋亡相關(guān)基因的調(diào)控可以控制食管癌細胞增殖，從而達到消除腫瘤細胞的目的。

大蒜素前藥；食管癌細胞Eca9706；增殖；凋亡基因

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，其典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也不能咽下。食管癌的發(fā)病因素眾多，與年齡、性別、職業(yè)、種族、地域、生活環(huán)境、飲食生活習(xí)慣、遺傳易感性等均有一定關(guān)系。中國每年約有25萬新診斷的食管癌病例，占全世界食管癌病例數(shù)的一半，目前尚無較好的方法治療食管癌，通常5年生存率不到15%［1］。目前有學(xué)者采用中醫(yī)藥治療食管癌，對于緩解梗阻、控制病情進展、防止轉(zhuǎn)移、減少腫瘤的發(fā)生有一定療效［2］。有研究表明［3］大蒜素對人食管癌細胞Eca9706具有增值抑制作用。但尚未有關(guān)大蒜素前藥抑制食管癌細胞的報道。查閱相關(guān)文獻［4］，發(fā)現(xiàn)大蒜素前藥性質(zhì)比大蒜素更穩(wěn)定。本研究通過使用不同濃度的大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706進行處理，探究大蒜素前藥對食管癌細胞的增值抑制與凋亡基因表達水平影響，現(xiàn)將研究方法和結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 食管癌細胞Eca9706（購自上海譜振生物科技有限公司）、新鮮大蒜（來自本地菜市場）、二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍（MTT）（上海寶曼生物科技有限公司）、PCR擴增試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）、PCR各引物（北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司）、RP-MI1640培養(yǎng)基和RP-MI1640培養(yǎng)液（上海浩然生物技術(shù)有限公司）、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）、cDNA合成試劑盒（北京嘉美紐諾生物科技有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將食管癌細胞Eca9706加到10%胎牛血清的RP-MI1640培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度設(shè)為5%，濕度設(shè)置為5%。RP-MI1640培養(yǎng)液每1.5 d更換1次，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞實驗。

1.2.2 大蒜素前藥制備：①新鮮大蒜，剝皮留瓣300 g，和磷酸緩沖液300mL一同置入4℃冰箱冷凍5min；②緩沖液和蒜瓣混合（W/V=1：1），制成均勻漿液，4℃溫度下4 000 r/min離心20min，留上清液；③上清液中加入硫酸銨，使液體飽和度達到20%，于4℃溫度下靜置2 h，后以8 000 r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心20 min，分離留取上清液置于干凈試管內(nèi)；④于上清液內(nèi)加入硫酸銨直至液體飽和度達到50%，4℃下靜置24 h，4℃低溫下8 000 r/min離心20min，沉淀、冷凍、干燥后獲得蒜氨酸酶。采用丙酮酸法［5］測定蒜氨酸酶的活力。測得蒜氨酸酶單位活力為24720 U/mg，SDS-PAGE檢測得一條分子質(zhì)量大小約為54 kDa左右的主要蛋白帶，與已有報道［6］分子質(zhì)量一致。按一定比例，將蒜氨酸酶稀釋成10、20、40μg/mL，另設(shè)置空白對照0μg/mL。

1.2.3 MTT法行細胞增殖抑制情況檢測：①細胞接種：以含10%胎小牛血清培養(yǎng)液配置單個細胞懸液，以每孔7 000個細胞、每孔體積200μL接種于96孔板，；②細胞培養(yǎng)：使用同樣的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基，分別加入A1組10μg/mL、A2組20μg/mL、A3組40μg/mL大蒜素前藥，以4.8μg/mL二烯丙基二硫化物（DADS）為對照，置入相同條件培養(yǎng)箱（溫度37℃，CO2濃度5%，濕度5%）中培養(yǎng)；③呈色：A1組、A2組、A3組分別培養(yǎng)1、2、3 d，每孔加入20μLMTT溶液（5 mg/mL，用PBS配制，pH= 7.4）。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)后小心吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液。每孔加150μL入DMSO，振蕩10min，充分融解結(jié)晶物；④比色：酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀波長設(shè)定為490 nm，測定各孔吸光值，記錄結(jié)果。其中，每個濃度組一共做5組，根據(jù)記錄結(jié)果求平均值。相關(guān)計算如下：細胞存活率=實驗組÷對照質(zhì)粒組×100%，以藥物濃度為橫軸，細胞存活率為縱軸繪制濃度效應(yīng)曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4 RT-PCR法檢測3組細胞在mRNA水平表達情況A1組（10μg/mL）、A2組（20μg/mL）、A3組（40μg/mL）、A4組（0μg/mL）分別處理同等條件下培養(yǎng)的食管癌細胞Eca9706，分別在培養(yǎng)至1、2、3 d時對β-actin進行水平測定。步驟如下：①樣品RNA的抽提：轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞提取每組細胞的總RNA；②RNA質(zhì)量檢測：分光光度計調(diào)零后取少量RNA溶液用TE稀釋（1：100）后，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度；③樣品cDNA合成：配置的樣品cDNA總反應(yīng)體系為10μL，輕彈管底將溶液混合，6000 r/min短暫離心，之后加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV，制得cDNA溶液；④樣品：p53陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μL按10倍稀釋為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，備用。陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機反應(yīng)40個循環(huán)；⑤模板：針對β-actin基因，選擇cDNA模板進行PCR反應(yīng)，共進行35個PCR循環(huán)，之后72℃延伸5min。將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度；⑥PCR：所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應(yīng)體系，之后將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Real-timePCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)，共40個循環(huán)，最后72℃7min延伸；⑦引物列表。在PCR擴增試劑盒、PCR各引物的基礎(chǔ)上參考文獻［7］進行引物設(shè)計。p53長度150bp。F：TACCACCATCCACTACAACTACAT；R：CCAGGACAGGCACAAACACG。⑧電泳：電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0進行，正態(tài)計量資料采用“±s”表示，計數(shù)資料采用率進行描述，滿足方差齊性的4組細胞的增值抑制情況和細胞在mRNA水平表達比較采用t檢驗，樣本率的比較采用卡方檢驗分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細胞不同時段的增值抑制情況比較 A2組在1、2、3 d的IC50值比其他組均高，20μg/mL大蒜素前藥為抑制食管癌細胞Eca9706的最佳濃度。而隨著培養(yǎng)時間的延長，IC50值逐漸下降，但在第2天時下降幅度最大，其最佳抑制時間為2 d（見表1）。

表1 4組細胞不同時段的IC50比較（μg/mL）Tab.1 Comparison of IC50 at different time in four groups（μg/mL）

2.2 RT-PCR法檢測4組細胞在mRNA水平表達情況 培養(yǎng)的3 d時間里，A1組、A2組和A3組的p53mRNA均低于A4組（空白組）。第1天至第3天，4組細胞的p53mRNA總體呈下降趨勢，且第3天下降幅度大于第2天。A1組、A2組和A3組治療3 d后，p53 mRNA下降幅度分別為36.04%、47.6%、50.87%，呈劑量依賴性（見表2）。

表2 4組細胞p53表達量比較Tab.2 Comparison of p53 expression quantity in four groups

3 討論

細胞增殖的失控是腫瘤細胞的基本生物學(xué)特征之一，大量的研究表明大蒜素及大蒜素前藥（大蒜組織損傷時釋放的蒜氨酸）通過抑制腫瘤細胞的增殖，影響細胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對抗癌藥具有增敏作用［8-9］。大蒜素及前藥是一種有機硫化物。大蒜組織損傷時會釋放蒜氨酸酶，蒜氨酸酶催化蒜氨酸縮合形成具有強烈辛辣味的大蒜素，其主要成分二烯丙基硫代亞磺酸脂，大蒜素遇光熱容易降解成二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物等含硫有機化合物。理化性質(zhì)不穩(wěn)定，常溫下可進一步分解，導(dǎo)致其活性下降，影響其藥理作用及療效［10-11］。而本文所用的大蒜素前藥比較穩(wěn)定，對胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等均具有較好療效，是治療癌癥腫瘤的重要藥物。

本研究通過不同濃度的大蒜素前藥分別作用于食管癌細胞Eca9706，發(fā)現(xiàn)：大蒜素前藥對食管癌細胞Eca9706的增值抑制的最佳濃度為20μg/mL，最佳抑制時間為2 d，其對食管癌細胞Eca9706基因水平的抑制呈劑量依賴性，該結(jié)果與常全娥［7］等的研究結(jié)果一致，表明使用20μg/mL的大蒜素前要可以達到最佳的細胞增殖抑制，而劑量依賴性則提示可以通過加大藥物劑量達到癌細胞抑制的目的，但由于本實驗所設(shè)置的濃度分組不多，關(guān)于產(chǎn)生耐藥性的劑量仍有待研究。大蒜素前藥通過干擾食管癌細胞Eca9706的mRNA表達，從而阻斷了基因的逆轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達，達到抑制癌細胞的目的，其原理可能是提高腫瘤組織內(nèi)cAMP水平從而抑制腫瘤的過度增殖，也可能是直接殺傷腫瘤細胞或者增強免疫細胞活性。

綜上所述，通過使用合適濃度的大蒜素前藥可以有效抑制食管癌細胞Eca9706的增值。通過對凋亡相關(guān)基因的調(diào)控可以控制食管癌細胞增殖，從而達到消除腫瘤細胞的目的。

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（編校：吳茜）

Analysis of effects of allicin prodrug on proliferation of esophageal cancer cell line Eca9706 and the expression of apoptosis gene

CHEN Yong-dong，SHAO Zhong-fu

（Department of Thoracic Surgery，The Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China）

ObjectiveTo explore and analyze the effects of allicin prodrug on proliferation of esophageal cancer cell line Eca9706 and the expression of apoptosis gene.MethodsDifferent concentrations of allicin prodrugs were divided into a total of four groups：A1 group（10μg/mL），A2 group（20μg/mL），A3 group（40μg/mL），A4 group（normal saline，0μg/mL），and respectively applicated in esophageal carcinoma cell line Eca9706.After culturing for 1 days，2 days，3 days，cell proliferation was detected by MTT and expression of p53 at the mRNA level was detected by RT-PCR.ResultsThe optimum concentration of proliferation inhibition of allicin prodrug on esophageal cancer cell line Eca9706 was 20μg/mL and the best inhibition timewas2 days；the gene levelofesophageal cancer cell line Eca9706 was inhibited with a dose-dependent.ConclusionAllicin prodrugs could effectively inhibit the proliferation of esophageal cancer cell line Eca9706，and control the proliferation of esophageal cancer cells by regulating the expression of apoptosis associated genes，so as to eliminate tumor cells.

allicin prodrug；esophageal cancer cell line Eca9706；proliferation；apoptosis gene

R966

A

1005-1678(2014）07-0043-03

國家自然科學(xué)基金（81101498）

陳永東，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病相關(guān)，E-mail：onecyd@163.com。